植物組織培養(yǎng)六(已修改)
2025-01-24 05:05 本頁(yè)面
【正文】 第七章 細(xì)胞培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)（ plant cell culture）是指在離體條件下對(duì)植物單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模 :小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；根據(jù)培養(yǎng)方式 :懸浮培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)等；根據(jù)要求產(chǎn)物 :用于誘變的細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)。 n 167。1. 單細(xì)胞分離 n 167。2. 懸浮培養(yǎng) n 167。3. 單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) n 167。4. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn) n 167。1. 單細(xì)胞分離由完整的植物器官分離單細(xì)胞由培養(yǎng)組織中分離單細(xì)胞由完整的植物器官分離單細(xì)胞葉片是分離單細(xì)胞的最好材料機(jī)械法酶解法撕去下表皮露出葉肉細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞1 機(jī)械法第一種方法：用刀片刮葉片第二種方法：葉片研碎、離心研碎成粉加研磨介質(zhì)過濾、離心只有薄壁組織排列松散，細(xì)胞間接觸點(diǎn)很少時(shí)用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功。1 酶 解法Takebe等（ 1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞加果膠 酶過濾 、離心由培養(yǎng)組織分離單細(xì)胞 莖段步驟搖 床用于振 蕩繼 代 懸 浮(3)（ Suspension culture)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物15ml medium/1g120rpm culture Transfer1 time/3d 3 weeks100130目網(wǎng) 過濾Centrifuge(離心） isolation注意 ： 選擇適宜的外植體 ：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。 選擇適宜的培養(yǎng)基 ：較高濃度激素濃度，特別是生長(zhǎng)素，必要的附加物質(zhì)，例如水解酪蛋白、 Pro、 Gln。 繼代多次，以獲得均勻一致疏松的愈傷組織。 167。2. 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture) 一、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義 懸浮培養(yǎng)是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。Bioreactorforcontinuous cellsuspensionsShakerforsuspensioncultureCulturewheel 細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度 的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。Cell suspensionPlants Artificial seedsSecondary productsIsolation protoplasts Mutation select細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用 三 .細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)基 對(duì)于用愈傷組織制備的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基以原愈傷組織繼代時(shí)的培養(yǎng)基除去瓊脂為好。為了提高細(xì)胞的分散度，對(duì)于生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例需要進(jìn)行一些調(diào)節(jié)。 培養(yǎng)細(xì)胞的起始密度及細(xì)胞記數(shù)（ 1）最低有效密度的概念 在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，使懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能夠增殖的最少接種量稱為最低有效密度或者臨界的起始密度。 最低有效密度由于培養(yǎng)材料、原種培養(yǎng)條件，原種保存時(shí)間長(zhǎng)短、培養(yǎng)基的成分不同而有差異，一般為 104~105細(xì)胞 /ml（ 2）細(xì)胞記數(shù)要保證細(xì)胞培養(yǎng)的最低有效密度，在細(xì)胞游離后要對(duì)分離的單細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)，可用血球記數(shù)板。（ 3）活細(xì)胞測(cè)定除測(cè)定細(xì)胞密度外，尚需要測(cè)定活細(xì)胞率以作為測(cè)定起始密度的參考活細(xì)胞率（ %） =（ 5個(gè)視野中的活細(xì)胞數(shù)/5個(gè)視野中的細(xì)胞總數(shù)） 100% 活細(xì)胞測(cè)定的方法；A、醋酸酯熒光素（ FDA）染色法 FDA本身無熒光，無極性，可自由通過原生質(zhì)體膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)入后由于 受到活細(xì)胞內(nèi)脂酶分解 ， 而產(chǎn)生有熒光的極性物質(zhì)熒光素，不能自由出入原生質(zhì)體膜 ，在熒光顯微鏡下觀察到的熒光是有活力的，反之無活力。具體操作： 取 ，加入FDA溶液，使最后濃度達(dá)到 %，混勻，室溫下作用 5min，熒光顯微鏡觀察。B、酚藏紅花染色法 先配制 %酚藏紅花溶液，溶劑為培養(yǎng)液。檢查時(shí)將懸浮細(xì)胞取一滴放在載玻片上，滴一滴 %酚藏紅花，蓋上蓋玻片，染成紅色的是死細(xì)胞，無色的是活細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目的增殖變化細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：滯后期 （延遲期） :細(xì)胞很少分裂，其長(zhǎng)短與接種量 大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 :細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長(zhǎng)速率保持不變直線生長(zhǎng)期 :細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期緩慢期 :生長(zhǎng)逐漸緩慢 ,培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝 物質(zhì)增多，氧氣減少靜止期 :生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。 討論 : A、滯后期的長(zhǎng)短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少。B、加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。 條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時(shí)間組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。C、 縮短兩次繼代時(shí)間間隔 ，則可使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一直保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。D、如果使處在 靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng) ，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡和解體 。操作注意事項(xiàng)：對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞繼代時(shí)，進(jìn)液口的孔徑要小，只能通過單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)（ 2 4細(xì)胞），使用吸管或注射器。繼代前 ，培養(yǎng)容器靜置短時(shí)間，大細(xì)胞團(tuán)沉降，再吸上層懸浮液。依此，多次，可建立良好的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定對(duì)于任何一個(gè)建立的細(xì)胞懸浮系都應(yīng)該進(jìn)行動(dòng)態(tài)的測(cè)定，以掌握其生長(zhǎng)的基本規(guī)律，為繼代培養(yǎng)或其他研究提供依據(jù)。A、細(xì)胞記數(shù)注意：由于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞并不會(huì)呈游離單
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