基因工程實驗流程ppt課件(已修改)
2025-09-23 18:24 本頁面
【正文】 基因工程實驗流程總覽 DNA提取，純化 限制圖譜 瓊脂糖電泳檢測片段 體外擴(kuò)增 PCR 目的基因制備 載體選擇 DNA重組片段連接 未知核酸序列須 DNA片段大小估計 互補(bǔ)性黏性 不互補(bǔ)性黏性末端 平末端 限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法簡單基因組分離如質(zhì)粒和病毒 物理化學(xué)法 構(gòu)建基因組文庫 PCR擴(kuò)增 基因的化學(xué)合成 雙抗體免疫法 酶促反應(yīng) mRNAcDNA 目的基因分離 雙酶切 部分酶切 Bal31逐步切割 轉(zhuǎn)座子 基因定位克隆 酵母雙雜交 前處理防止自連 RNA提取 RTPCR TA克隆 藍(lán)白選擇 膠回收 表達(dá)引物 PCR 載體 PCR產(chǎn)物回收 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 構(gòu)建基因組文庫 ? 真核生物有成千上萬個堿基對，單個未知基因在整個基因組中的比例很小且不能在體外特異性擴(kuò)增，所以只能對所有基因擴(kuò)增，也就是構(gòu)建基因組文庫。 油菜 TOC33基因片的克隆 ? 實驗項目背景 國家自然科學(xué)基金項目 （ 油菜葉綠體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)突變體中差異表達(dá)基因的克隆 ， 編號： 30170500） 。 ? 實驗?zāi)康? 通過本綜合實驗 ， 掌握植物基因組 DNA的制備技術(shù) 、 PCR技術(shù) 、 限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù) 、 重組 DNA技術(shù) 、 克隆鑒定技術(shù) 、 質(zhì)粒 DNA的制備 、 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù) 、 測序技術(shù) 、 生物信息技術(shù)等 ， 得到一個與科學(xué)研究過程相近的分子生物學(xué)綜合技能訓(xùn)練 。 具體實驗步驟 ?Ⅰ .植物基因組 DNA的制備 ?Ⅱ .TOC33基因片段的 PCR擴(kuò)增 ?Ⅲ . DNA的瓊脂糖凝膠上回收與純化 ?IV. DNA片段的體外重組與轉(zhuǎn)化 ?V. 克隆的篩選與鑒定 ? Ⅰ. 植物基因組 DNA的制備 ? 取 EP管中 ， 放在液氮中冷凍處理后 ， 在 EP管中充分搗碎 ， 加入 抽提緩沖液 ， 65℃ 水浴處理 10min。 ? 12,000rpm離心 3min， 取上清 ， 加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀 ， 遇有絮狀沉淀 ， 4,000rpm離心 5min。 ? 沉淀用 50ul TERNase（ pH ， EDTA pH ，RNase A 30ug/mL） 溶解 ， 37℃ 保溫處理 15min。 ? 加入二倍體積預(yù)冷的無水乙醇 ， 20℃ 下沉淀 10min ， 4,000rpm離心 3min，加適量 70%乙醇洗沉淀 ， 自然干燥或 37℃ 烘干 ， 加入 50ul ddH2O溶解備用 。 Ⅱ .TOC33基因片段的 PCR擴(kuò)增 ? 引物設(shè)計，為擴(kuò)增 Toc33片段，用 OLIG05. 0設(shè)計 1對 PCR引物 : 上游引物 P1: 539。一 ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT339。， 下游引物 P2： 539。一 TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一 339。 ? 在 25ul反應(yīng)體系： 10 PCR Buffer ul Mg2+ ul dNTP ul Primer 1 ul Primer 2 ul Taq 酶 ul 模板 ul ddH2O ul 1) 94 oC 預(yù)變性 5 min 2) 94 oC變性 30 sec 3) 55 oC退火 30 sec 4) 72 oC延伸 45 sec 5) 重復(fù)步驟 2)4)30次 6) 72 oC延伸 10 min ? 瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR結(jié)果 1) 稱取 ， 再加入 1ml 50 TAE緩沖液 ， 49ml 高水 ，置微波爐或水浴加熱至完全融化 ， 取出搖勻 ， 則為 1％ 瓊脂糖凝膠液 。 2) 取電泳槽里面的膠板 ， 用膠帶將兩端封好 ， 調(diào)平 ， 并放好樣品梳子 。 3) 將冷到 60oC左右的瓊脂糖凝膠液 ， 緩緩倒入膠板 ， 直至膠板上形成一層均勻的膠面 。 4) 待膠凝固后 ， 取出梳子 ， 放在電泳槽內(nèi) 。 電泳槽內(nèi)應(yīng)加入電泳緩沖液 。 5) 用移液槍將已加入上樣緩沖液的 PCR產(chǎn)物加入加樣孔 。 6) 接通電泳槽和電泳儀的電源 （ 注意正負(fù)極 ， DNA片段從負(fù)極向正極移動 ） ；選擇合適的電壓 ， 開始電泳； 7) 當(dāng)溴酚藍(lán)燃料移動倒距離凝膠前言 1－ 2cm處 ， 停止電泳 。 8) 將電泳的凝膠浸入溴化乙錠染色液中 ， 染色 10min后取出 ， 用清水沖洗 。將膠放于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照 ， 以觀察樣品在瓊脂糖凝膠中的帶 （ EB有劇毒 ， 戴手套操作 ） 。 ? 電泳染色后，在紫外分析儀上切取所需要的條帶，按 1克膠： 1000添加提取緩沖液，放在 60度的金屬浴中溶解。然后把溶液轉(zhuǎn)移到試劑盒專用管中， 6000轉(zhuǎn) /分離心 1分鐘； ? 倒掉上清，再加入 500微升的 extraction buffer,12022r/min離心 1分鐘； ? 倒掉上清，加入 750微升的 wash buffer ,12022r/min離心 1分鐘； ? 倒掉上清，重復(fù)步驟三； ? 倒掉上清，在 12022r/min下空轉(zhuǎn) 1分鐘； ? 把帶有膜的管子換到新的 EP管中，加入 30~50微升的水，靜置 1分鐘，12022r/min離心一分鐘，即
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