【正文】 1 臨床藥理研究所 2 現(xiàn)代生物技術(shù) 基因工程技術(shù) 細(xì)胞工程技術(shù) 酶工程技術(shù) 發(fā)酵工程技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng) 3 細(xì)胞分離技術(shù) ? 從血液、體液中分離細(xì)胞 ? 從原代組織中分離細(xì)胞 ? 從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞 傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng) 4 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 采血方法： ? 人 靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血； ? 小動(dòng)物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心臟穿刺法、斷頸取血或股動(dòng)脈放血。 ? 兔 耳靜脈或動(dòng)脈穿刺取血。 5 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 血液抗凝方法： ? 肝素法 ：按每 ml血液約用 （即 5%肝素溶液 24181。l）； ? 草酸鹽法： 取草酸鉀 ，草酸銨 ，加雙蒸水 10ml溶解后，取 5ml的試管中，使其干燥。若采用 5ml以下的血液可直接注入此試管中，輕輕搖晃； ? 枸櫞酸鈉法： 先配制 2%枸櫞酸鈉，取 1ml血液中即可抗凝； ? EDTA法 （ ）：每 ml血液中加 。 6 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 體液標(biāo)本采集： 在局部 70%酒精消毒滅菌后，用滅菌注射器穿刺入體腔（如胸腔，腹腔，關(guān)節(jié)腔等）抽取液體樣品。 膝關(guān)節(jié)腔穿刺 胸腔穿刺 7 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 血樣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分離： 利用細(xì)胞的相對(duì)密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法結(jié)合不同速度的離心沉降法將不同的細(xì)胞分離。 抗凝血，室溫或 37℃ 下直立靜置 3060min，紅細(xì)胞沉降至下層，中間乳白色薄膜層為白細(xì)胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血與 3%明膠（經(jīng)滅菌消毒）等量或 3︰ l量混合于離心管中，直立靜置 3060min，紅細(xì)胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細(xì)胞。 8 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 血中單個(gè)核細(xì)胞的分離： 單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其相對(duì)密度在，采用速度沉降法原理使其分離。 淋巴細(xì)胞分離液 9 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 血中單核細(xì)胞的分離： 利用細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中貼壁時(shí)間的早晚不同進(jìn)行細(xì)胞分離 單個(gè)核細(xì)胞懸液 多將懸液放入 12cm直徑的培養(yǎng)皿中，于 37℃ 培養(yǎng)箱中靜置 3060min。此時(shí)單核細(xì)胞貼壁，而淋巴細(xì)胞尚未貼壁，傾出未貼壁細(xì)胞，并用 Hanks液輕輕沖洗培養(yǎng)皿以盡量洗下 未貼壁細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）。 用 Hanks液強(qiáng)力沖洗吹打與震蕩，將貼壁的單核細(xì)胞沖落或用刮刀輕刮，收集 貼壁的單核細(xì)胞 。 計(jì)數(shù)后分別制備所需濃度的細(xì)胞懸液。 10 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 黏附法分離血中單核細(xì)胞、 T， B淋巴細(xì)胞 因 B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞能黏附于尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），所以可將其與 T淋巴細(xì)胞分離。 11 具體步驟： ? 單個(gè)核細(xì)胞用含 20%小牛血清 RPMI1640制成（ ） 107/ml的細(xì)胞懸液。 ? 先用 Hanks液，再用含 20%小牛血清的 RPMI1640液沖洗平衡尼龍纖維柱，沖洗液盡量流凈。 ? 將尼龍柱預(yù)溫 37℃ ，再用配制的單個(gè)核細(xì)胞懸液 2ml裝入尼龍纖維柱，不使流出， 37℃ 溫箱內(nèi)靜置 l小時(shí)。 ? 取下注射針頭，用預(yù)溫 37℃ 含 20%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)液沖洗尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的 T淋巴細(xì)胞。 ? 從注射器內(nèi)取出尼龍纖維，在 4℃ 的 RPMI1640液內(nèi)漂洗，并輕輕擠壓，將黏附的 B細(xì)胞洗脫收集（ B淋巴細(xì)胞中混有的單核細(xì)胞可用貼壁法將其分離）。 ? 收集的 T、 B淋巴細(xì)胞可分別用 Hanks液懸浮，洗滌，離心（ 250g，7min），并重復(fù)洗滌 3次。計(jì)算活細(xì)胞，計(jì)數(shù)懸液中的細(xì)胞數(shù)后制備所需濃度的 T和 B淋巴細(xì)胞懸液。 12 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 免疫磁珠法 (MACS)分離 T、 B淋巴細(xì)胞： 磁性微珠是 20世紀(jì) 80年代初以高分子材料和金屬離子（如 Fe3O4）為原料聚合而成的一種以 金屬離子為核心 、外層均勻地包裹 高分子聚合體 的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場(chǎng)的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對(duì)某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體 即可制成免疫磁性微珠。 13 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 免疫磁性微珠 用于細(xì)胞的分離和純化 的基本原理及步驟是：首先將抗特異細(xì)胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細(xì)胞反應(yīng)后，利用磁力的作用，使與致敏結(jié)合的細(xì)胞與其它物質(zhì)分離，達(dá)到純化、分離的目的。 通常有二種分離方式： 陽(yáng)性分離 和 陰性分離 。陽(yáng)性分離是直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞，陰性分離是利用磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以分離。 14 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 免疫磁珠分離細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于人類各種細(xì)胞的分離，如 T(CD3)、B(CD19)淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞 (CD34)、造血祖細(xì)胞 (CD34)、單核 /巨噬細(xì)胞 (CD14)、胰島細(xì)胞 (胰島 GK和 GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子） ) 、多種腫瘤細(xì)胞等。 15 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 16 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 17 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 18 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 MACS技術(shù)優(yōu)點(diǎn) ： ? 穩(wěn)定、高質(zhì)量的分選 ：純度（ 9099%） ? 對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷 ? 操作簡(jiǎn)便、快速： 消毒方便，手動(dòng)分選 30分鐘內(nèi)完成， autoMACS分選 。 ? 從實(shí)驗(yàn)室到臨床： MACS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn) 1051011個(gè)細(xì)胞分選。有 autoMACS和 CliniMACS。 ? 分選后細(xì)胞適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)： 分選后適用于細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分選得到的標(biāo)記和未標(biāo)記細(xì)胞組分均可回收利用。 ? 從細(xì)胞到分子分選： 不僅可以分選各種細(xì)胞，還可以分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞、亞細(xì)胞物質(zhì)、蛋白質(zhì)、 DNA、RNA及 mRNA。 MACS技術(shù)缺點(diǎn)： ?分離效率較流式細(xì)胞儀分選略低 ?且耗材相對(duì)較貴，適合無(wú)大型流式細(xì)胞儀設(shè)備且對(duì)分選細(xì)胞純度要求不高的分選。 ?只適用于簡(jiǎn)單標(biāo)記的細(xì)胞分離 19 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)分離法分離 T、 B淋巴細(xì)胞： ? 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用 RPMI1640培養(yǎng)基配成 1 107 /ml； ? 加適量 FITC抗 CD3或 FITC抗 CD19， 4℃ 孵育 30min, 用 RPMI1640培養(yǎng)基洗 2次； ? 用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細(xì)胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行分選。 20 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 注意事項(xiàng)： ? 分選細(xì)胞常用于細(xì)胞亞群進(jìn)一步的功能研究，因此，整個(gè)過(guò)程均需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，流式細(xì)胞儀進(jìn)行無(wú)菌沖洗。 ? 此法分離得到的 T細(xì)胞純度可達(dá)到 99%,收獲率可達(dá)到 90%。 ? 由于噴嘴孔很?。s 70～ 100μm），分選前用 30～ 40μm孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以免堵塞噴嘴。 21 細(xì)胞分離技術(shù) 從血液、體液中分離細(xì)胞 優(yōu)缺點(diǎn)： ?流式細(xì)胞儀分選純度較高、回收率高，分選一些具有比較復(fù)雜細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞時(shí)相當(dāng)有用的，例如要分選出白血病人骨髓中某些 CD34+CD13CD45dim的幼稚細(xì)胞，只需要在流式上簡(jiǎn)單地邏輯設(shè)門就可以了，而且流式可以雙通道分選，也就是同一時(shí)間分選出兩種細(xì)胞，流式分選成本比磁珠低。 ?流式分選最致命的缺點(diǎn)就是污染，且設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，需專業(yè)技術(shù)人員操作，操作費(fèi)時(shí)，適合對(duì)細(xì)胞純度和回收率要求較高的分選。 22 細(xì)胞分離技術(shù) 二、從原代組織中分離細(xì)胞 組織和器官采集： ?人標(biāo)本： 可采取無(wú)菌手術(shù)法切取少量所需的組織或器官（活檢和手術(shù)）。 ?大量的動(dòng)物組織： 先麻醉或處死，浸入 70%酒精中，使毛皮全部浸濕，從腹中線剪開皮膚，注意不要剪開胸腔或腹腔。將皮膚向上、下撕開分離并向上、下翻開，暴露胸腹部的筋膜，用生理鹽水洗凈黏于筋膜上的斷毛，以碘酒和 70%酒精消毒后，更換一套消毒滅菌的器械，剪開胸腔或腹腔，無(wú)菌采取所需器官。 ?動(dòng)物的骨髓： 可以無(wú)菌手術(shù)采取一段股骨，用滅菌注射器，將小牛血清或培養(yǎng)液從斷端一端加壓注射以從另一斷端出骨髓。 23 細(xì)胞分離技術(shù) 從原代組織中分離細(xì)胞 制備細(xì)胞懸液方法： ? 將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，最常用的是 機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法 以及 螯合劑解離細(xì)胞法 。 ? 從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是 酶解聚 。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持最大的活性。包括 胰蛋白酶、膠原酶 和 中性蛋白酶 等。 24 細(xì)胞分離技術(shù) 從原代組織中分離細(xì)胞 (Trypsin) 在去除不需要的組織后，使用無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，重復(fù)清洗 2到 3次。用無(wú)菌的解剖刀和剪子把組織切成 12mm3小塊。 將盛有組織碎片的容器置于冰上。加入 ％溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（ 100mg組織加入 1ml 胰蛋白酶）。 25 細(xì)胞分離技術(shù) 從原代組織中分離細(xì)胞 在 4℃ 孵育 6到 18小時(shí)，使胰蛋白酶盡可