實(shí)驗(yàn)四、細(xì)胞器分離、制備與觀察(已修改)
2025-10-26 16:03 本頁(yè)面
【正文】 實(shí)驗(yàn) 4 細(xì)胞器分離、制備與觀察 I 線粒體制備與活性鑒定 【 目的 】 1．掌握分離制備動(dòng)物和植物細(xì)胞線粒體的方法。 2．對(duì)分離得到的線粒體進(jìn)行活性鑒定。 【 原理 】 ? 線粒體（ mitochondria）是真核細(xì)胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中的能源物質(zhì) —— 脂肪、糖、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過(guò)藕聯(lián)磷酸化生成 ATP，供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。 ? 將動(dòng)植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細(xì)胞線粒體。在一定的離心場(chǎng)中 (選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速 )，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器沉降先后順序是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。 ? 懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性； 的條件下；亞細(xì)胞組分不容易重新聚集成團(tuán)，有利于分離。整個(gè)操作過(guò)程樣品要保持在 0℃ ~4℃ ，避免酶失活。 ? 細(xì)胞器標(biāo)記酶的測(cè)定是評(píng)價(jià)細(xì)胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠 B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。 ? 詹納斯綠 B是一種活體染料，能對(duì)動(dòng)、植物的細(xì)胞或組織在活體狀態(tài)下進(jìn)行無(wú)毒害的染色。由于染料 (堿性染料 )的膠粒表面帶有陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒表面帶陰離子，而被染部分本身具有陰離子或陽(yáng)離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆集下來(lái)。染色法可以顯示出活細(xì)胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實(shí)性，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以至引起細(xì)胞的死亡。 鼠肝線粒體的分離 【 材料 】 鼠肝臟或豬肝臟。 【 實(shí)驗(yàn)用品 】 1．試劑： (1) mol／ L蔗糖 + mol
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