【正文】 基因工程緒論 克隆（clone）：作名詞：含有目的基因的重組DNA分子或含有重組分子的無性繁殖。作動(dòng)詞：基因的分離和重組的過程。 基因工程（gene engineering）：體外將目的基因插入病毒、質(zhì)粒、或其他載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入到原先沒有這些基因的宿主細(xì)胞內(nèi)，且能穩(wěn)定的遺傳。供體、受體和載體是基因工程的三大要素。 基因工程誕生的基礎(chǔ) 三大理論基礎(chǔ)：40年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA；50年代弄清楚DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理；60年代確定遺傳信息的遺傳方式。以密碼方式每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子代表一個(gè)氨基酸。 三大技術(shù)基礎(chǔ)：限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)；DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)；載體的發(fā)現(xiàn) 基因工程的技術(shù)路線：切：DNA片段的獲得；接：DNA片段與載體的連接；轉(zhuǎn)：外源DNA片段進(jìn)出受體細(xì)胞；選：選擇基因；表達(dá)：目的基因的表達(dá)；基因工程的工具酶 限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes）：主要是從原核生物中分離純化出來的，是一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。 限制酶的命名：屬名（斜體）+種名+株系+序數(shù)II型限制性內(nèi)切酶識別特定序列并在特定位點(diǎn)切割同裂酶：來源不同，其識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同的限制酶。同尾酶：來源不同，識別的靶序列不同，但產(chǎn)生相同的黏性末端的酶形成的新位點(diǎn)不能被原來的酶識別。限制性內(nèi)切酶的活性：在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性內(nèi)切酶的量為1個(gè)酶活力單位。星號活性：改變反應(yīng)條件，導(dǎo)致限制酶的專一性和酶活力的改變。DNA連接酶的特點(diǎn)：具有雙鏈特異性，不能連接兩條單鏈DNA分子或閉合單鏈DNA，連接反應(yīng)是吸能反應(yīng)，最適反應(yīng)溫度是4至15度，最常用的是T4連接酶。S1核酸酶：特異性降解單鏈DNA或RNA。RNAH降解與DNA雜交的RNA，用于cDNA文庫建立時(shí)除去RNA以進(jìn)行第二鏈的合成。1DNA聚合酶：(1)、DNA聚合酶I：5’—3’外切酶活性、3’—5’外切酶活性，5’—3’聚合酶活性，用途：除去3’端突起。補(bǔ)齊5’端突起。合成cDNA第二鏈。切口移位探針的制備。(2)、Klenow大片段：沒有5’→3’外切酶活性，而保留了5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。用途:用同位素標(biāo)記具5’端突起的DNA片段末端。補(bǔ)平5’粘性末端。DNA序列測定。合成cDNA第二鏈。(3)、Taq酶：75度為最適反應(yīng)溫度，95度仍具有穩(wěn)定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。1 主要修飾酶：(1)堿性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基團(tuán)。(2)T4多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移5’OH上 (3)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在3’端高效添加脫氧核苷酸。 分子克隆載體 分子克隆載體：是一類可供外源DNA片段插入并攜帶重組分子進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的DNA分子。 分子克隆載體的功能：（1） 為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力（2） 為外源基因提供在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合的能力（3） 為外源基因提供在受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)的能力 載體的分類：(1) 按用途分：克隆載體、表達(dá)載體、整合載體(2) 按來源分：原核生物載體：質(zhì)粒載體、λ噬菌體載體、M13噬菌體載體、cosmid載體、phagemid載體；真核病毒載體 載體的特點(diǎn)：（1） 至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一個(gè)生物體中自主復(fù)制（2） 至少有一個(gè)克隆位點(diǎn)，可供外源DNA插入（3） 至少有一個(gè)標(biāo)記基因，以知識載體或重組DNA分子是否進(jìn)入受體細(xì)胞（4） 具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 標(biāo)記基因的作用：外源基因是否插入載體分子形成重組子；外源載體是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 標(biāo)記基因的種類：抗性標(biāo)記基因；營養(yǎng)標(biāo)記基因；生化標(biāo)記基因；噬菌斑 常用的遺傳標(biāo)記基因：四環(huán)素抗性基因（Tc）；氨芐青霉素抗性基因（Ap）；氯霉素抗性基因（Cm）；卡那霉素（Kan）；新霉素（Neo）；β—半乳糖甘酶基因（LacZ)；葡萄糖苷酸酶基因（Gus）；熒光素酶基因；發(fā)光蛋白質(zhì)基因。 按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體：1） 質(zhì)粒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體（有低拷貝和高拷貝）2） ARS復(fù)制型—染色體復(fù)制型（一般拷貝數(shù)比較高）3） 病毒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自病毒，若為RNA必須反轉(zhuǎn)錄為cDNA（高拷貝）4） 混合復(fù)制型：不同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合（穿梭載體） 根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分：質(zhì)粒載體、病毒型載體、混合型載體 根據(jù)載體功能分類：1）普通型載體：至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因。如PBR322和pUC載體2）表達(dá)型載體：3類：Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動(dòng)子）+終止子；Ⅱ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼 子）+終止子；Ⅲ型: 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+ 翻譯起始區(qū)+ 信號肽鏈編碼區(qū)+ 終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體） 3）失控型質(zhì)粒載體(Runaway plasmid vector)：是一些低拷貝質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型或藥物敏感型，在不同溫度或不同藥物濃度下，質(zhì)?？截悢?shù)會(huì)顯著變化。 4）探針型載體：該類載體主要 特點(diǎn)是含有一些特殊的DNA序列，用于特定的研究目的，如分離基因啟動(dòng)子、終止子、DNA復(fù)制起點(diǎn)等。 5)定序型載體：主要用于核苷酸的序列測定 6)整合型載體：主要用于基因治療，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。標(biāo)記基因與拷貝的關(guān)系：若標(biāo)記基因的表達(dá)效率較高，宿主細(xì)胞可能不大量表達(dá)標(biāo)記基因以滿足選擇壓力的要求，因而載體的拷貝數(shù)會(huì)降低，可采取相應(yīng)方法提高拷貝數(shù)。如：對于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物的濃度。對于營養(yǎng)標(biāo)記基因，可降低該基因的表達(dá)效率。大腸桿菌分子克隆載體 1）質(zhì)粒載體—復(fù)制起點(diǎn)來自一些天然質(zhì)粒。 2）噬菌體載體—λ，P1和M1fd載體，復(fù)制起點(diǎn)來自噬菌體。 3）COS質(zhì)粒載體—質(zhì)粒載體中插入λcos片段，以利于體外包裝 4）噬粒載體（phagemid）—有質(zhì)粒和M1fd的復(fù)制起點(diǎn)，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制。 質(zhì)粒的特點(diǎn)：1） 質(zhì)粒DNA的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)2） 質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在3） 質(zhì)粒DNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)移4） 質(zhì)粒的不相容性和不相容群5） 質(zhì)粒DNA的消除6） 質(zhì)粒的整合 大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制：以RNAⅡ?yàn)橐锖铣?，RNAⅠ與RNAⅡ結(jié)合可減少質(zhì)粒的拷貝數(shù)，使RNAⅠ復(fù)制起點(diǎn)上游一個(gè)核苷酸處G突變?yōu)門，使得拷貝數(shù)增多。 質(zhì)粒的不親和性：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。主要是由于他們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成。 λ噬菌體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12個(gè)核苷酸，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。 熱誘導(dǎo)表達(dá)：λcl ts857 ，可作為組件插入質(zhì)粒 DNA 內(nèi)。目的基因插在λcl ts857 下游，重組體的目的基因在 42 ℃表達(dá)， 30 ℃不表達(dá)。 λ噬菌體載體的缺點(diǎn)：基因組太大；酶切點(diǎn)太多；野生型只能接納一定長度的DNA。 λ噬菌體載體的改造：切去非必須片段，加載目的基因 去掉太多的酶切位點(diǎn) 增加標(biāo)記基因 COS質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：在普通質(zhì)粒載體中插入一個(gè)或兩個(gè)來自λ的cos位點(diǎn)片段，雙cos載體比單cos載體易于重組。 COS質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：容量大，用于基因簇的克??；形成的重組DNA分子可進(jìn)行體外包裝，并能感染大腸桿菌細(xì)胞；操作簡單，易于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；對重組DNA分子長度具有選擇性包裝。1 噬粒載體（phagemid）：在質(zhì)粒載體中插入一段M13或fd的復(fù)制起點(diǎn)，其插入方向決定在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈?；虿僮鞯闹饕夹g(shù)原理 核酸分離提取的原則：保證核算的一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除其他分子的污染 質(zhì)粒載體分離的關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒與DNA與宿主染色體DNA分開 依據(jù)：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA提取過程中，染色體斷裂成片段，而質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型變性法提取質(zhì)粒DNA的原理：在變性條件（堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補(bǔ)鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)變性條件恢復(fù)時(shí)，質(zhì)粒DNA迅速復(fù)性恢復(fù)天然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。 RNA分離純化的關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用 RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿；抗高溫嚴(yán)寒；抗變性劑，酶活性不需要輔助因子，存在范圍廣。因此操作時(shí)要進(jìn)行高溫滅菌或用焦碳酸二乙酯處理或強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑等。 核酸的濃縮：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的鹽離子和雜質(zhì)。 核酸凝膠電泳的基本原理：核酸分子中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在電場中將向正極移動(dòng)，通過凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分離，分子量小的DNA，具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動(dòng)快；反之，分子量大的DNA移動(dòng)慢。 核酸凝膠電泳常使用溴酚藍(lán)作為指示劑、溴化乙錠作為染色劑脈沖場凝膠電泳原理：加在凝膠上至少有兩個(gè)電場方向，使得DNA分子要不斷地調(diào)整泳動(dòng)方向，不同分子量大小的DNA分子用于改變泳動(dòng)方向的時(shí)間不同，則可以得到分離雙脫氧核苷酸終止法的原理：雙脫氧（239。，339。）核苷酸可以象239。脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3’端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列1雙脫氧核苷酸終止法的過程：制備單鏈DNA，與引物退火，分為4個(gè)反應(yīng)體系，每個(gè)體系中加入dNTP和一種雙脫氧核苷酸，DNA聚合酶定序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳，凝膠干燥，放射自顯影，根據(jù)條帶讀出堿基序列，再根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則寫出DNA鏈的序列。（注意：要自己寫一個(gè)序列，然后寫上每個(gè)體系中出現(xiàn)片段的序列，然后根據(jù)序列畫出電泳圖，考試考的可能性大，書上有步驟）1MaxamGilbert化學(xué)法原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)，在堿性環(huán)境下硫酸二甲酯能使堿基G發(fā)生甲基化，在酸性環(huán)境下哌啶甲酸使A和G脫嘌呤，堿性環(huán)境下肼使C和T發(fā)生開環(huán)，在高鹽濃度下肼只使C開環(huán)。然后發(fā)生1~2個(gè)堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列1化學(xué)法測序的優(yōu)點(diǎn)、不需要模板、引物和DNA聚合酶。1Southern雜交（Southern blot）：用一種或多種限制性內(nèi)切酶對基因組DNA加以切割，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，隨后，使DNA在原位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用已知核苷酸片段加以標(biāo)記作為探針，通過分子雜交來檢測待測樣品中是否存在互補(bǔ)的核酸序列。 Southern雜交的一般步驟：DNA的制備→DNA酶切→電泳（瓊脂糖凝膠電泳）→DNA原位轉(zhuǎn)膜→探針雜交→放射自顯影→結(jié)果分析1 Northern雜交檢測的是RNA。步驟與southern類似，不需要酶切。1 Western雜交：雜交的對象是蛋白質(zhì)，先將蛋白質(zhì)從SDSPAGE中轉(zhuǎn)移到一固相支持物上，通過與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反應(yīng)進(jìn)行檢測。主要用于基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測。 Western雜交的一般步驟：蛋白質(zhì)制備→SDSPAGE→電轉(zhuǎn)移至膜上→一抗的制備→一抗與膜結(jié)合（1h）→洗膜（30min）→二抗與膜的結(jié)合→洗膜→顯色反應(yīng)→結(jié)果分析1PCR反應(yīng)體系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超純水。1引物設(shè)計(jì)的一般原則：引物的長度常為17至30個(gè)堿基；GC含量為40%至60%；Tm值高于55；兩條引物之間配對堿基數(shù)小于5；引物自身配對的堿基數(shù)小于3?；蛭膸斓慕?基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。 建立基因組文庫的一般程序:1) 載體DNA片段的制備：DNA分離，限制酶切割，脫磷酸化反應(yīng)2) 供體DNA片段的制備：總DNA純化，再進(jìn)行機(jī)械或酶切割成特定大小的DNA片段。3) 供體和載體DNA的連接:要注意混合的比率和濃度4) 重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴(kuò)增5) 基因組文庫質(zhì)量的評價(jià)：文庫規(guī)模、重組頻率 利用λ載體構(gòu)建基因組文庫:1) 載體DNA片段的制備的方法：左右臂DNA片段的獲得2) 供體DNA片段的制備：限制酶部分酶切，機(jī)械剪切法3) 重組DNA分子的形成：控制混合的比率4) 重組DNA分子的包裝：制備包裝物，然后進(jìn)行包裝5) 基因組文庫的擴(kuò)增 為提高文庫的質(zhì)量，采取以下措施:1） 雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體2） 供體DNA脫磷酸化以避免供體DNA間的連接導(dǎo)致重排3） 載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形發(fā)生:載體補(bǔ)CT，供體補(bǔ)GA4） 采用文庫快速構(gòu)建法以避免擴(kuò)增文庫時(shí)DNA丟失 基因組文庫的載體可載入DNA大?。?） 質(zhì)粒 最大15kb 適合構(gòu)建cDNA文庫；亞克隆2） 噬菌體 最大25kb cDNA文庫3） COS質(zhì)粒 3045kb 基因組文庫4） 噬粒 最大12kb cDNA文庫5） P1 7090kb 基因組文庫6） BAC 100500kb 基因組文庫7） YAC 2501000kb 基因組文庫 鳥槍法克隆目的基因：隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA