生化綠色熒光蛋白的基因克隆及表達(dá)開題報告(已修改)
2025-08-17 09:44 本頁面
【正文】 學(xué)號 ： 班級： 姓名：《生 物 化 學(xué) 與 生 物 分 子 學(xué) 實 驗》 ——分 子 生 物 學(xué) 設(shè) 計 性 實 驗 開 題 報 告實驗課題：綠色熒光蛋白的基因克隆及表達(dá)指導(dǎo)老師：作者姓名：所在院系：小組編號：小組成員：完成時間：成都醫(yī)學(xué)院 Cheng Du Medical College題目：綠色熒光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)立題依據(jù)： 隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用, 人們根據(jù)自己的意愿有目的、有計劃、有根據(jù)、有預(yù)見地將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi), 使外源基因進行表達(dá)、闡明基因表達(dá)的調(diào)控機理或者通過與染色體基因組進行穩(wěn)定整合，將生物性狀傳遞給子代動物的研究方興未艾[1]。：大腸桿菌 大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點。而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌中蛋白量的30 %，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。 基因標(biāo)記技術(shù)是近年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)。熒光蛋白基因在標(biāo)記基因方面由于具有獨特的優(yōu)點而引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已被普遍應(yīng)用到分子生物學(xué)研究的各個方面。熒光蛋白是海洋生物體內(nèi)的一類發(fā)光蛋白，分為綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白[2]。從水母(Aequorea victoria)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，第65～67位氨基酸(SerTyrGly)形成發(fā)光團，是主要發(fā)光的位置。其發(fā)光團的形成不具物種專一性，發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報道基因。 【實驗?zāi)康摹? 研究綠色熒光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)。 【研究意義】研究綠色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的基因克隆和表達(dá)。通過質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET28aGFP，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，通過酶切、PCR及用IPTG誘導(dǎo)檢測是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)成功。根據(jù)電泳結(jié)果及熒光現(xiàn)象得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達(dá)。GFP的應(yīng)用特點 檢測方便：不需要外加底物和輔助因子，用內(nèi)眼就可以觀察到，在長紫外光照射下特別漂亮，以此作為標(biāo)記，觀察表達(dá)產(chǎn)物。 實驗題目包含的內(nèi)容 本實驗的目的是通過BamH I和Not I兩種限制性內(nèi)切酶的消化把EGFP基因從pEGFPN3質(zhì)粒中克隆出來，或者用PCR方法把EGFP基因從pEGFP—N3質(zhì)粒中擴增出來。并定向插入到表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒的多克隆位點(MCS)中，用此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出帶有N端HisTag的融合蛋白。表達(dá)了GFP的菌體在離心管中則會呈黃綠色，在紫外光激發(fā)下發(fā)射出特異的綠色熒光，從而證明了目的蛋白的表達(dá)是否成功。另外在菌體總蛋白的SDSPAGE電泳圖譜中如果出現(xiàn)了明顯的誘導(dǎo)條帶，則條帶中蛋白濃度與誘導(dǎo)時間呈正相關(guān)
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