【正文】 超聲法提取大青葉中總黃酮的工藝及其抗氧化活性研究超聲法提取大青葉中總黃酮的工藝及其抗氧化活性研究畢業(yè)論文目 錄前 言 1 3 3 3 5 9 12 12 14 19 23 24 試劑及藥品 24 24 24 25 25 26 27 27 27 33 實驗儀器 33 33 Folin—Ciocalteu比色法測定總酚酸含量 33 Folin—Ciocalteu試劑的配制 33 33 34 34 35自由基能力的測定 藥品及試劑 41 實驗儀器 41 41能力的測定 41 DPPH配制 41 41 43。 43+自由基能力的測定 4藥品及試劑 48 實驗儀器 48 48+測定 49 ABTS+自由基的配制 49 49 51+自由基能力的影響 51 56致謝 59參考文獻 601 前 言 黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。它們分子中有一個酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。 近年來， 針對黃酮類化合物的藥理活性的研究有很多。由于黃酮類化合物分布廣泛，所以它們具有多種藥理活性。經(jīng)研究表明，黃酮具有很好的心血管系統(tǒng)活性，不少治療冠心病的中成藥里均含有黃酮類化合物。黃酮除了具有心血管活性之外，還具有抗菌及抗病毒活性、抗菌及抗病毒活性、抗炎。此外，大量研究表明黃酮類化合物還具有降壓、降血脂、抗衰老、提高機體免疫力、瀉下、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙及抗變態(tài)等藥理活性。用超聲波有機溶劑法提取黃酮類物質(zhì)，是近幾年來新發(fā)展的方法，具有效率高、時間短、操作簡便、節(jié)能等優(yōu)點。超聲提取技術(shù)的基本原理主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取。因此，超聲波不僅大大縮短了提取時間，而且提高了有效成分的提出率以及原料的利用率。而且超聲提取技術(shù)能避免高溫高壓對有效成分的破壞。 自由基與人的病理（心臟病、糖尿病、腫瘤、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕等）、生理（衰老）有密切關(guān)系。生物體內(nèi)常見的自由基有超氧自由基、羥自由基、烷氧自由基。自由基性質(zhì)活潑，有極強的氧化能力，對人體能造成極大危害，在體內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化作用下能使大分子成分發(fā)生氧化變性、交聯(lián)和斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，從而引起癌癥等退變性疾病，黃酮類化合物有很好的清除自由基和抗氧化能力，對防止疾病以及人的健康有積極意義。 黃酮化合物具有很好的清除自由基和抗氧化能力，能阻止自由基在體內(nèi)的產(chǎn)生。其作用機理包括與超氧反應(yīng)阻止自由基引發(fā)連鎖反應(yīng)；與金屬離子鰲合阻斷自由基的生成，與脂質(zhì)過氧化基 ROO反應(yīng)阻斷脂質(zhì)過氧化過程。 用 DPPH法、ABTS+法測定了總黃酮提取物的清除自由基能力。通過試驗證明，提取物具有較強的清除DPPH自由基、清除ABTS+自由基的能力，說明提取物含有能清除羥基自由基、烷基自由基或者過氧自由基的抗氧化物質(zhì)。 本文以大青葉為研究對象，就其中總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性進行了探討。大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz）為馬鞭草科（Verbenaceae）落葉灌木，又稱為羊咪青、路邊青根（根的中藥名）、路邊青葉（葉的中藥名）、臭大青、淡婆婆（湖南）、山靛青（浙江）、路邊青、大青木。大青高1~2m。根皮淡黃色。嫩枝有短柔毛，莖無毛。也對生，單葉；葉片橢圓形或長圓狀披針形，長6~17cm，寬4~，頂端漸尖，基部圓形或?qū)捫ㄐ危吘壢?，兩面無毛或沿葉脈有疏短柔毛，葉背常有腺點，揉之有臭氣，6~9月開花，花白色，排成傘房狀聚傘花序生于枝頂或葉腋；花萼五裂；花冠長約1cm。5裂；雄蕊4枚，明顯伸出花冠外。6~9月結(jié)果，果實球形或倒卵形，直徑5~10mm，成熟是藍紫色，為紅色的花萼所托。生于山坡、路旁、荒地、溝谷邊、疏林灌叢中。河南、山東、浙江、江蘇、江西、安徽、湖南、湖北、福建、臺灣、廣東、廣西、海南、貴州、云南、西藏等省區(qū)有生產(chǎn)；越南、朝鮮、馬來西亞等地也有[1]。據(jù)《藥用植物學(xué)》、《中國民間百草良方》、《實用中草藥原色圖》等記載，大青全株均能入藥。 大青的藥名，最早見于《名醫(yī)別錄》?！侗静萁?jīng)集注》（約公元480~498年前）云：“大青，味苦、大寒、無毒，主療時氣頭痛、大熱口瘡，三四月采莖陰干，陶弘景云：…本經(jīng)又無，今出東境及近道?！彪m然套隱居敘述簡單，但是說明了兩點：其一是大青絕非是藍，因為大青在《神農(nóng)本草經(jīng)》（約公元25~220年）中并無記載，而藍早已列入《神農(nóng)本草經(jīng)》的上品之中，從時間先后上來看，如果大青就是藍的話，那么陶弘景是不會說“本經(jīng)又無”的話。其二是陶弘景是江蘇隱居人士，因此“東境及近道”，則指江南一帶，說明大青是一種生長在南方的植物。 宋《本草圖經(jīng)》記載“大青，今江東州郡及荊南、眉、濠（皖）、蜀、淄（魯）諸州皆有之，花紅紫色，似馬蓼，亦似芫花”等等描述，并附有大青圖，依據(jù)它的描述和附圖，很難辨別出是什么植物，但是可以從圖中可以看出此植物是葉對生，在所比較的7中植物中除了馬鞭草科的大青和爵床科的馬藍是葉對生之外，其他5種植物都是葉互生。馬藍的葉雖然是對生，但其他的特征不符合大青的本草學(xué)記載。在《本草綱目》中，對大青的描述則更加的詳細(xì)了，云“……高二三尺，莖圓，葉長三四寸，面青背淡，對接而生，八月開小花，紅花成簇，結(jié)青實，大如椒顆，九月色赤。”所附的圖和馬鞭草科的大青基本相同。吳其濬《植物名實圖考》在《本草綱目》的基礎(chǔ)上，加以考訂說：今江西、湖南山坡所繪的圖也異常清晰，與現(xiàn)代植物分類學(xué)馬鞭草科大青一致。大青在歷代草本及各附圖均無混亂，與目前所用的馬鞭草科植物大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.）一致，應(yīng)為正品。但現(xiàn)今實際應(yīng)用反限于江西省局部地區(qū)，而全國其他地區(qū)均被藍類植被植物所代替，藍類植物入藥歷史早于大青，《神農(nóng)本草經(jīng)》已載，自《唐本草》后提出的藍實有五種，其中已有菘藍、蓼藍、和馬藍的描述，其共同的特點是均可作為染青的染料，所以以后記述的大青葉實質(zhì)上均是指這些藍類植物的品種。藍和大青的同名異物現(xiàn)象，還存在于我國各地的重要市場上，為了保證要安全有效，本著一藥、一物、一名的原則，建議將大青葉列為菘藍葉、馬藍葉、蓼藍葉，以此來區(qū)別大青葉。本文則研討的是馬鞭草科的大青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.）。大青全株含異戊烯聚合物、半乳糖醇、鞣質(zhì)、豆甾醇、γ谷甾醇、大青苷、柳杉酚、二十五烷、木栓酮（無羈帖烷3酮）、赪桐甾醇、赪桐二醇烯酮[4]。 （無羈帖烷3酮） 大青根含uncinatone、22droclerosterol、friedelin[3]、李艷[6]等人從大青根中分離出18種化合物，其中鑒定出13種分別是類葉升麻苷、darendosideB、對羥基苯乙醇βD葡萄糖苷、苯乙醇βD葡萄糖苷、syringaresinol439。OβDglucopyranoside、連翹苷、4羥基2,6二甲氧基苯基βD葡萄糖苷、香草酸、沒食子酸、琥珀酸、甘露醇、腺苷、β谷甾醇。 3. Friedelin 39。OβDglucopyranoside ,6二甲氧基苯基βD葡萄糖苷 大青葉含正十三醇、正二十五烷、339。甲氧基薊黃素cirsilineol439。OβDglucoside[6]、山大青苷。 39。甲氧基薊黃素 39。OβDglucoside 此外，《海南島天然抗癌本草》、《中藥大詞典》、《一味中藥祛頑疾》等書刊上，均記載大青葉含有大青素B、靛苷，化學(xué)研究表明，蓼藍、菘藍、馬藍除均含靛藍、靛玉紅外蓼藍含有14種氨基酸及23種無機元素，菘藍葉中也含有16種游離氨基酸及23中無機元素，但馬藍葉僅檢出有微量的谷氨酸，馬鞭草科大青的化學(xué)成分中不含有大青素B、靛甙及吲哚酚的衍生物（靛藍、靛玉紅等)[5]。目前人們對大青的研究較少，尤其是藥理作用幾乎無人報道，先對其藥理作用及臨床作用做一綜述。⑴大青的傳統(tǒng)醫(yī)藥應(yīng)用在《中藥大辭典》中記載大青有防治齒痛、痢疾之效。在《實用中草藥原色圖譜》中記載大青有清熱解毒，消炎鎮(zhèn)痛，涼血止血，祛風(fēng)除濕之效。 在《中國民間百草良方》中記載大青有清熱解毒，涼血之效。 在《福建民間草藥》中記載大青有消炎鎮(zhèn)痛，除濕祛風(fēng)之效。 在《植物名實圖考》中記載大青有治偏頭風(fēng)之效。 在《海南常用中草藥名錄》中記載大青有清熱解毒、利水之效。 在《廣西野生資源植物》中記載大青有洗爛瘡之效。在《陸川本草》中記載大青有涼血退熱，解皮膚熱毒，蜈蚣咬傷之效。⑵大青的現(xiàn)代作用①抗炎及殺菌作用大青的葉在贛、湘、鄂、浙、粵等省部分地區(qū)作大青葉使用，具明顯抗炎作用[8]，對痢疾桿菌、副大腸埃希菌有強的抑制作用，對腦膜炎球菌亦有殺菌作用。對鉤端螺旋體波蒙那群、黃疸出血群沃爾登型，七天熱型也有殺滅作用[9]。②利尿作用 現(xiàn)代研究，大青葉中含有黃酮類物質(zhì)山大青甙，對大鼠有利尿作用[8]，對大鼠蛋清性“關(guān)節(jié)炎”及右旋糖肝性“關(guān)節(jié)炎”均有明顯的抗炎作用，但在張慧勤等人的研究報道中[11]對大鼠蛋清實驗性關(guān)節(jié)炎的作用的實驗結(jié)果表明大青對大鼠蛋清性“關(guān)節(jié)炎”并沒有抗炎作用。③鎮(zhèn)痛作用 在張慧勤等人[9]的研究報道中表明大青具有鎮(zhèn)痛作用,取體重19~25此行小白鼠33只，隨機分3組。其中2組分別用大青木醇提液13g/kg,20g/kg灌胃，1次/d,，連續(xù)3d。另1組給等容量生理鹽水作為對照。采用熱辦法測定痛閾，調(diào)節(jié)水溫至55℃177。℃，以舐后足或騰空跳躍的動作為痛覺指標(biāo)。于給藥前每只小鼠測定2次，取平均值為該鼠藥前痛閾值。各組動物于第3d給藥后30min、60min、90min分別測痛閾2次，取平均值為藥后痛閾值，結(jié)果表明大青木醇提取液均有鎮(zhèn)痛作用。④降壓作用 在林東明等人[10]研究報道中，大青木水煎劑及山大青甙均對實驗狗產(chǎn)生緩慢而持久的降壓作用，而且對甲腎上腺素、腎上腺素均產(chǎn)生血壓明顯先升高而后降低現(xiàn)象。⑶大青的臨床應(yīng)用 大青可防治流行性腦脊髓膜炎、流行性乙型腦炎，治療感冒頭痛，麻疹并發(fā)肺炎，流行性腮腺炎，扁桃體炎，傳染性肝炎，痢疾，尿路感染，熱身黃疸，溫病，血熱發(fā)班，壯熱不退以及血熱妄行的上部出血癥等。①預(yù)防流行性腦脊髓膜炎 大青根1500g、白茅根、馬蘭、金銀花藤、蘆根、貫眾各250g加水15000ml，煎成12500g，為50人量，每人服量250g分為3次服用[1]。②治療流行性乙型腦炎 用大青葉治療流行性乙型腦炎，效果顯著。治療方法：大青葉500g,加水3000ml，文火煎至1600ml。用法：5歲以下者50ml，每6小時服1次；6~12歲者100ml，每6小時服一次；11歲以上者100ml，沒4小時服1次，帶體溫降至正常后3天停藥。療效；治療23例，全部治愈，無1例死亡和后遺癥。服藥量最少者480ml，最多者600ml，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[7]。③小兒上呼道感染 取大青葉30g，加水40ml，煎至10ml，再加水30ml，煎至10ml，混合兩次煎液。3歲以上每次6ml，每天3~6次。治療小兒上呼道感染168例，平均退熱時間17小時左右，平均住院時間為4天。全部痊愈[7]。④治療細(xì)菌性痢疾及急性胃腸炎 成人每日用于大青葉45g煎汁1次頓服， 或90g分2次分服，連服至痊愈后1~2日停藥[6]。⑤單純皰疹角膜炎 用大青葉洗眼劑。大青葉洗眼劑的制備方法：大青葉250g,加水5000ml，煮沸1小時，過濾，濾渣再依法煮1次，合并兩次濾液，濃縮至125ml,冷卻，加乙醇375ml，混合均勻，放置24小時，濾紙過濾，回收回收乙醇煎煮至無乙醇臭味，加生理鹽水1000ml，再加防腐劑氰氧化汞使其濃度為1:500，用10%NaOH點pH值至7。濾紙過濾，裝鹽水瓶，加蓋密封，蒸氣消毒備用。用時以5ml置眼浴杯中，浸泡角膜15~20min，浸后用土霉素眼膏包蓋，每天1次，連續(xù)至角膜熒光素染色陰性為止。在治療期間，除口服維生素C及維生素B2外，局部及全身均不再加用抗生素或其他特殊治療。治療37例，角膜熒光染色陰性，角膜上皮長好者29例，中途停止治療8例。療程最短5天，最長31天[7]。⑥淋巴腺炎 大青葉50g、芙蓉葉15g、蒲公英30g、金銀花9g，水煎，分3賜福，每日1劑，連服3~5天[11