【正文】 本 科 畢 業(yè) 論 文 題 目（中文）： 基因芯片篩選斑馬魚胚胎FBL基因相關差異表達基因及信號通路 （英文）： Gene chip filter the related genes and signal pathways of zebrafish emybryo FBL gene 目 錄中文摘要…………………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………………………………1一、前言…………………………………………………………………………21．1斑馬魚心臟發(fā)育相關的基因及信號通路…………………………………5 1， 相關基因介紹…………………………………………………………5 1． 相關信號通路介紹……………………………………………………71．2．Morpholino技術…………………………………………………………101．3，具體到FBL基因的研究進展…………………………………………111．4．基因芯片技術……………………………………………………………12二、材料和方法…………………………………………………………………142．1．生物信息學軟件…………………………………………………………142．2．Morpholino………………………………………………………………142．3．基因芯片…………………………………………………………………142．4信息分析方法………………………………………………………………16三、實驗結果……………………………………………………………………17四、討論…………………………………………………………………………304．1．Wnt signaling pathway（ WNT信號途徑）……………………………304．2．VEGF signaling pathway（血管內皮生長因子信號途徑）……………314．3．Calcium signaling pathway(鈣信號轉導途徑) …………………………324．4．Parkinson39。s disease（帕金森氏癥）……………………………………324．5．MAPK signaling pathway（MAPK信號通路）………………………334．6．Regulation of actin cytoskeleton（肌動蛋白細胞骨架調節(jié)）…………344．7．TGFbeta signaling pathway（轉化生長因子β信號通路）…………344．8．Leukocyte transendothelial migration（白細胞經內皮遷移）…………364．9．Oxidative phosphorylation(氧化磷酸化) ………………………………364．10．Ribosome（核糖體）…………………………………………………364．11．Cell Communication（細胞通訊）……………………………………374．12．Cell cycle(細胞周期) …………………………………………………394．13. Ubiquitin mediated proteolysis（泛素介導的蛋白質降解）…………39五、參考文獻……………………………………………………………………41致謝……………………………………………………………………………43摘要 基因芯片篩選斑馬魚胚胎FBL基因相關差異表達基因及信號通路 彭湃湖南師范大學生命科學學院生物科學專業(yè)2006級摘要：本文對斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因干擾相關基因芯片表達數據進行了信息學分析，篩選得到差役表達基因534個，信號通路119 條，分析發(fā)現wnt信號通路，轉化生長因子β信號通路，MAPK信號通路等，與斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因功能相關，研究結果為研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程中這些基因即信號通路與胚胎發(fā)育的關系提供了基礎，加深了對胚胎發(fā)育機理的理解。關鍵詞： 斑馬魚 基因芯片 心臟發(fā)育 FBL基因Gene chip filter the related genes and signal pathways of zebrafish emybryo FBL gene Pai PengGrade 2006, biological science，College of life science，Hunan Normal UniversityAbstract：In this paper, zebrafish embryos FBL siRNA expression microarray data related to information analysis, and render screened 534 genes, signal pathway 119, analysis wnt signaling pathway, transforming growth factorβ signaling pathway, MAPK signaling pathway and so on, and the zebra fish embryo development FBL gene function related to the study results during the embryonic development of zebrafish genes that these signaling pathways and embryo development provides the foundation to deepen the understanding of the mechanism of embryonic development.Key words： Zebrafish Gene chip Heart development FBL gene前言斑馬魚是研究發(fā)育生物學的新興模式動物。斑馬魚由于具有飼育容易、胚胎透明、體外受精、突變種多、遺傳學工具成熟等諸多優(yōu)點，近年來已成為研究脊椎動物發(fā)育與人類遺傳疾病的新興模式動物。與其他脊椎動物相較下，斑馬魚最大的優(yōu)點就是具有多達6,000多種的遺傳突變種，這些突變種的建立大致上是利用X射線、ENU或反轉錄病毒的感染造成基因組的突變，之后再經由多次的子代篩選所得。這些突變種的表征包含如胚層分化，器官發(fā)育，生理調適與行為表現等多方面，所以可提供研究人員極佳的正向遺傳學材料來進行發(fā)育機制上的研究。另外在斑馬魚系統中也開發(fā)出阻斷基因功能的工具Morpholino，可快速以逆向遺傳學手法來驗證基因的功能。所以正向遺傳學與逆向遺傳學的巧妙利用，可以正確推導出斑馬魚遺傳發(fā)育途徑。以下簡述斑馬魚胚胎發(fā)育過程：斑馬魚的繁殖周期約7天左右，一年可連續(xù)繁殖67次。我們把斑馬魚的胚胎發(fā)育分為7個時期。分別為受精卵期，卵裂期，囊胚期，原腸胚期，分節(jié)期，咽胚期和孵化期，然后進入幼魚階段。時期hpf描述受精卵期0受精卵完成了第一次細胞分裂。卵裂期第2至第7個細胞周期（第9）過渡到較長的、不同步的。囊胚期從快速的、同步的細胞周期（第9個）過渡到較長的、不同步的細胞周期；然后開始進行外包。原腸胚期包括內卷、集中和外延在內的形態(tài)發(fā)生運動形成了上胚層、下胚層以及胚軸；直至完成外包過程。分節(jié)期10體節(jié)、咽弓原基、神經原節(jié)開始發(fā)育；開始進行主要器官發(fā)生；出現最早的運動；出現尾巴。咽胚期24身體軸線開始從卵黃囊周圍的曲線逐漸伸直；循環(huán)系統、色素形成和鰭都開始發(fā)育。孵化期48完成主要器官的快速形態(tài)發(fā)生；頭部和胸鰭的軟骨開始發(fā)育；孵化不同步的發(fā)生。幼魚期72鰾開始充氣；出現覓食及主動躲避行為。 1細胞 2細胞 4細胞 8細胞 早期囊胚 中期囊胚 晚期囊胚 原腸胚期 24小時 一天 兩天 三天 幼魚 成魚1．斑馬魚心臟發(fā)育相關的基因及信號通路相關基因介紹： 心臟特異表達的轉錄因子是在早期的心臟區(qū)域被激活表達的。其中。對于心臟前體細胞的分化最早的研究來源于果蠅。研究發(fā)現，果蠅中tinman基因的突變抑制了果蠅心臟的形成。tinman基因編碼的是homeobox轉錄因子，這個因子屬于Nk2基因家族。，并且它的表達貫穿于心臟發(fā)育的整個過程。在人和老鼠的心臟發(fā)育過程中， 的突變都能導致心臟發(fā)育的嚴重缺陷。由于 ， 以及它在心臟形成過程中的重要作用，tinman/。目前，對于斑馬魚突變株faust（fau）和acerebellar（ace）的研究結果表明，他們影響了 ， fau/gata5， 而其表達的維持則需要 ace/fgf8。 BMP2 在心臟的特化過程中，心肌原始細胞產生于前端的側板中胚層 （ALPM），位于前端側板中胚層下方的前端內胚層對于調節(jié)心肌細胞的誘導就有著重要的調節(jié)作用。目前的試驗也證實了前端內胚層對于誘導和維持心臟分化進程的重要作用。內胚層能夠分泌FGFs、Activin和BMP等多種信號分子。其中，BMP2 能夠在非心臟的區(qū)域誘導心肌細胞marker基因的表達。Noggin和BMPs分子高度親和從而阻止了體外培養(yǎng)的側板中內胚層心肌細胞的分化。心臟分化起初不穩(wěn)定，需要一個持續(xù)不變動的環(huán)境刺激來保證心臟分化的穩(wěn)定發(fā)生。在斑馬魚和非洲爪蟾中這種穩(wěn)定性就是依賴于BMP信號途徑，因此，BMP2的存在限定了心臟區(qū)域起始分化的界限。 GATA 基因家族 GATA家族是一類具有鋅指結構的轉錄因子，在心臟的形成中也具有重要的作用。在脊椎動物的心臟中表達3種GATA基因：gata 4~6。在斑馬魚中，GATA5的功能與老鼠中 GATA4的功能類似。斑馬魚gata 5由faust位點編碼，對faust突變體的研究表明，在早期的胚胎發(fā)育過程中，GATA5對于產生正常數量的心肌前體細胞以及維持一些心肌特異表達的基因，包括 。同時心臟原始細胞向胚胎中軸遷移的過程也需要GATA5的參與，因此gata 5的突變體會導致兩側的心臟原始細胞最終不能融合而形成心臟二分（CardiaBifida）的表型。GATA5 。目前在斑馬魚和非洲爪蟾中越來越多的試驗證明，用反義morpholino寡聚核苷鏈工具使gata 6基因的功能缺失后，心臟細胞的分化受到了影響。GATA6 的這種作用更多地體現在心臟原始細胞的成熟過程中，而不是起始誘導的過程。在斑馬魚中已經證明了GATA 。據報道，從而調控了ANF、CARP（cardiac restricted ankyrin repeat protein）啟動子等基因的表達。，發(fā)揮著協同的激活效應：，導致蛋白質構象的改變， 的激活結構域。在這個過程中，GATA5 。，激活下游某些心臟特異基因的表達。相關的重要信號途徑： WNT11信號途徑對心臟原始細胞會聚過程的調控在脊椎動物胚胎發(fā)育的過程中，許多器官的前體細胞誘導分化都是位于體軸的兩側，隨后朝著胚胎中軸會聚，最后組裝成一個最原始的器官。心臟的發(fā)育過程也遵循這樣的過程，首先在斑馬魚 6 個體節(jié)發(fā)育時期，心肌的前體細胞從前端的側板中胚層分化出來并且位于體軸的兩側。隨后這兩側的細胞再向中間遷移，最終會聚形成原始的管狀心臟。如果這一過程受阻，兩側的細胞不能正常會聚，則會出現心臟二分的表型。2000年Heisenberg的研究小組指出，在斑馬魚中，wnt11非經典信號途徑調節(jié)了原腸運動中的向中會聚和延伸的過程（Convergence and Extension Movement）。而后又有研究確定了非經典的Wnt 信號途徑中參與這一過程的一些分子。后來的研究又進一步證明了斑馬魚胚胎的會聚延伸運動需要Wnt非經典途徑中的一些胞內分子，包括RhoA、RacCdc42和JNK等。同時Wnt4a和Wnt11r又被確定為調節(jié)會聚延伸過程的2個新型分子。而且同時下調Wnt4a和Wnt11r 或者下調Wnt4a或Wnt11r與Slb/wnt11的組合，相比下調單個分子而言，會聚延伸過程將出現更嚴重的缺陷。非經典Wnt信號通路下游有很多的分枝， 涉及這一過程調控的有Dvl/RhoA 分枝，另外還有Rho Kinase2分枝。在非洲爪蟾和老鼠的研究中還發(fā)現， Wnt11 信號途徑還參與了心臟細胞的分化， 以及心臟可收縮表型的誘導。而在雞胚的研究中卻發(fā)現神經管分泌的Wnt信號能抑制前端鄰近的軸旁中胚層心臟的形成。但是在斑馬魚中，目前還沒有關于Wnt 信號是否對于心臟分化有影響的研究報道。這也說明關于Wnt 信號通路在