【正文】 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 1 第五章 CellQuest 軟件 學(xué)習(xí)本章后應(yīng)能夠： ? 用 CellQuest 從流式細(xì)胞儀獲取 3色或 4色樣本 ? 用 CellQuest 從流式細(xì)胞儀分析 3色或 4色樣本 ? 將統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸出為電子表格 ? 應(yīng)用 Region（區(qū)）和 Gate（門）生成統(tǒng)計(jì) ? 獲取和分析 3色免洗絕對(duì)記數(shù)樣本 概述 CellQuest是從流式細(xì)胞儀上進(jìn)行獲取和分析數(shù)據(jù)的通用軟件。 CellQuest軟件功能強(qiáng)大且靈活，并與 Macintosh 的多任務(wù)環(huán)境完全兼容。也可通過(guò) CellQuest調(diào)節(jié)儀器條件，設(shè)定獲取最佳條件并 可將其儲(chǔ)存。 獲取 即收集并儲(chǔ)存流式細(xì)胞儀上數(shù)據(jù)的過(guò)程。在獲取前，需用您的樣本來(lái)優(yōu)化儀器的條件。 分析 將獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。在分析時(shí)，將讀取數(shù)據(jù)文件，然后可畫 Region(區(qū) )、 設(shè)置 marker (標(biāo)尺 )和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在 CellQuest中，可畫單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)點(diǎn)圖、密度圖和等高圖。 從獲取到分析 在 CellQuest中，從獲取到分析的功能允許在數(shù)據(jù)獲取結(jié)束后可從獲取圖轉(zhuǎn)換到分析圖。剛剛獲取的數(shù)據(jù)及在獲取時(shí)限定的格式出現(xiàn)在圖中 ，如 region, marker,color 等。 工具板 工具欄可用來(lái)畫圖、 region, marker和文字等。點(diǎn)擊選擇。 工具板按鈕 (見(jiàn)圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖：點(diǎn)擊，可畫等高圖，可自定義圖的大小。 2. 選擇：點(diǎn)擊，可選擇一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)，進(jìn)行改大小或移動(dòng)。 3. 3 維圖：點(diǎn)擊，可畫 3維圖，可自定義圖的大小。 4. 直方圖：點(diǎn)擊，可畫直方圖，可自定義圖的大小。 5. 密度圖：點(diǎn)擊，可畫密度圖，可自定義圖的大小。 6. 點(diǎn)圖：點(diǎn)擊，可畫點(diǎn)圖，可自定義圖的大小。 7. 直 方圖 marker：點(diǎn)擊，可在直方圖上定位 marker 的左邊界和右邊界。 8. 象限 marker：點(diǎn)擊，可在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 9. 縮?。狐c(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊圖，將放大圖縮小到原大小。 10. 放大：點(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊圖，將縮小圖放大到原大小。 11. 矩形 region：點(diǎn)擊，然后在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖中點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至所需 大小。 12. 多邊形 region：點(diǎn)擊，然后在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖中點(diǎn)擊形成起始點(diǎn)，然后拖動(dòng)鼠標(biāo) 畫出多邊形頂點(diǎn)并在起始點(diǎn)處點(diǎn)擊完成多邊形 region 。 13. 直方圖 region：點(diǎn)擊 ，可在直方圖上定位 region 的左邊界和右邊界 14. 橢圓形 region: 點(diǎn)擊，然后在點(diǎn)圖、密度圖和等高圖中點(diǎn)擊，然后拖動(dòng)對(duì)角線至所需大小。 15. 箭頭：點(diǎn)擊，然后在實(shí)驗(yàn)文件中點(diǎn)擊，拖出直線。 16. 文本：點(diǎn)擊，然后點(diǎn)擊定位插入點(diǎn)并編輯文字。 17. 計(jì)算器：如果自動(dòng)復(fù)計(jì)算關(guān)閉，點(diǎn)擊進(jìn)行數(shù)據(jù)復(fù)計(jì)算。 CellQuest 的文件： FCS list mode數(shù)據(jù)文件 ：是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件（ ）。當(dāng)Aqusition Control 窗口的 Setup前未打 ? 時(shí)，進(jìn)行獲取后自動(dòng)保存的文件格 式。該文件含有從流式細(xì)胞儀獲取的平均 202010000個(gè)顆粒數(shù)的數(shù)據(jù)。一個(gè)含有 4參數(shù) 10000細(xì)胞數(shù)的數(shù)據(jù)文件若 256道分辨率則文件大小為 45kb，若 1024道分辨率則文件大小為 85kb。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 3 CellQuest實(shí)驗(yàn)文件 ：您設(shè)置的圖、 region、 gate、統(tǒng)計(jì) (statistics)、 markers、文字、顏色 等都將保存。數(shù)據(jù)文件不在實(shí)驗(yàn)文件中保存。 CellQuest實(shí)驗(yàn)文件的菜單由File菜單下 New、 open、 close、 save及 save as等 (同 Microsoft Word)。 注意：實(shí)驗(yàn)文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。若數(shù)據(jù)文件未改變目錄或被刪除，實(shí)驗(yàn)文件可找到其數(shù)據(jù)文件。若二者聯(lián)系喪失，需將丟失的數(shù)據(jù)文件放在其實(shí)驗(yàn)文件同一目錄，實(shí)驗(yàn)文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。若實(shí)驗(yàn)文件的目錄改變，二者的聯(lián)系不會(huì)改變，實(shí)驗(yàn)文件仍可找到其數(shù)據(jù)文件。 ? 實(shí)驗(yàn)文件可以后打開(kāi)以恢復(fù)獲取和分析。 ? 實(shí)驗(yàn)文件可以通用模板儲(chǔ)存以用于常規(guī)獲取和分析。除數(shù)據(jù)文件外所有條件（包括region、 gate、 statistics）都可以通用模板儲(chǔ)存。 ? 實(shí)驗(yàn)文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。 ? 在實(shí)驗(yàn)文件中，有 3種圖：獲取、分析和獲 取到分析。一個(gè)實(shí)驗(yàn)文件可含上述 3種圖的組合，但獲取圖不能用來(lái)分析，分析圖不能用來(lái)獲取。 CellQuest 的儀器控制： 在數(shù)據(jù)收集之前，需用樣本優(yōu)化儀器條件。在優(yōu)化之前需運(yùn)行 FACSComp.。需為每一組樣本選擇適當(dāng)?shù)膶?duì)照，如：判斷非特異性結(jié)合的同型對(duì)照。在 CellQuest軟件中， 儀器的控制菜 單位于 Cytometer 菜單中。 在用 CellQuest進(jìn)行 3色或 4色分析中，應(yīng)用同型對(duì)照和調(diào)補(bǔ)償用對(duì)照進(jìn)行儀器條件設(shè) 置。 同型對(duì)照包括下列試劑：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。 它將用 于調(diào)節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設(shè)淋巴細(xì)胞 region、確認(rèn)FL1/FL2/FL3/FL4的設(shè)置及象限設(shè)置。調(diào)補(bǔ)償用對(duì)照包括單陽(yáng)性熒光試劑和同型對(duì)照試劑，如：調(diào) FITC補(bǔ)償對(duì)照包括下列試劑： CD3－ FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。 調(diào)節(jié)探測(cè)器和放大器可使所需信號(hào)出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當(dāng)位置。顆粒通過(guò)激光束時(shí)產(chǎn) 生光 信號(hào)，然后轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并在點(diǎn)圖上相對(duì)應(yīng)于一個(gè)道值。依據(jù)所選的分辨率的不同，道 值有從 0－ 25 0－ 1023不同范圍。 探測(cè)器 ： 在流式細(xì)胞儀中有二種探測(cè)器：光電二極管和光電倍增管 (PMTs)。 光電二 極管對(duì)光 的敏感度低于光電倍增管。 光電二極管用于探測(cè) FSC，因?yàn)?FSC是強(qiáng)信號(hào)?？赏ㄟ^(guò)電壓而選擇對(duì) FSC 信號(hào) 的不同放 大。 (見(jiàn)圖 2) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 4 E00：將信號(hào)放大 1(100)倍。 E01：將信號(hào)放大 10(101)倍。 E02: 將信號(hào)放大 100(102)倍。 E03: 將信號(hào)放大 1000(103)倍。 E1: 將信號(hào)放大 (101)倍。 光電倍增管 (PMTs)用于探測(cè) SSC、 FL FL FL3, 因?yàn)樗鼈兪侨跣盘?hào)。 PMTs的電 壓調(diào)節(jié) 從 150－ 999。當(dāng)電壓上升時(shí)，信號(hào)增加，數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處?？赏ㄟ^(guò)點(diǎn)擊 ?? 來(lái)選 擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。 (見(jiàn)圖 2) 放大器 ： 可對(duì)信號(hào)進(jìn)行微調(diào)。對(duì) FSC、 SSC、 FL FL FL3 可設(shè)置放大模式 和放 大增益。 若 放大模式選擇 Lin(線性 )，放大器的增益 可在 1－ 。可通過(guò) 點(diǎn)擊 ??來(lái)選擇或直接拖 動(dòng)滑 標(biāo)上下移動(dòng) (見(jiàn)圖 2)。若放大模式選擇 Log(對(duì)數(shù) )，放大器的增益則不可調(diào)節(jié)。 對(duì)數(shù)常用 于 分開(kāi)陰性信號(hào)和弱陽(yáng)性信號(hào)。 閾 值 ： 可用來(lái)設(shè)置低于該道值的數(shù)據(jù)信號(hào)不被處理，只有高于或等于閾值道數(shù)的信號(hào)才傳送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。每次只能有一個(gè)參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)。 在免疫表型中， 在 FSC上設(shè)閾值。在 DNA分析中，在 FL2上設(shè)閾值?？赏ㄟ^(guò)點(diǎn)擊 ??來(lái)選擇或直接拖動(dòng) 滑標(biāo)上下移動(dòng) (見(jiàn)圖 3)。 新版的 CellQuest軟件有雙重閾值設(shè)定。 補(bǔ) 償： 當(dāng)樣本用 2色或 3色熒光染色時(shí)需調(diào)節(jié)補(bǔ)償以消除光譜重疊。因?yàn)闊晒馑匕l(fā)射一定波段的熒光，因此在探測(cè)某種特定熒光素的探測(cè)器上有來(lái)源于另一種熒光素的熒光信號(hào)。 FITC主要出現(xiàn)在 FL1探測(cè)器上，但也有 部分重疊到 FL2探測(cè)器上。 PE主要出現(xiàn)在 FL2探測(cè)器上，但也有 部分重疊到 FL1和 FL3探 測(cè)器上。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)如下： FL2－％ FL1： 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL1 FL1－％ FL2： 從 FL1探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL3－％ FL2： 從 FL3探測(cè)器上減去重疊的 FL2 FL2－％ FL3： 從 FL2探測(cè)器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè) 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補(bǔ)償調(diào)節(jié)量依賴于探測(cè)器的電壓。當(dāng)補(bǔ)償過(guò)后的群體與陰性群體一致時(shí)，補(bǔ)償調(diào)節(jié)正確。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過(guò)點(diǎn)擊 ??來(lái)選擇或 直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。 (見(jiàn)圖 4) 狀 態(tài)： 用來(lái)在獲取的任何時(shí)候查看流式細(xì)胞儀的運(yùn)行狀態(tài)，以利解決儀器運(yùn)行中出現(xiàn)的問(wèn)題。在菜單位于 Cytometer菜單中 (見(jiàn)圖 5)。 測(cè)試脈沖： 在 FACSCalibur中可從 status菜單中選擇 FSC(僅 FSC探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或ALL(所有探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào) )或 OFF。 狀態(tài)： 顯示儀器運(yùn)行模式 Not Ready: 激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊(cè)