【正文】 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 1 第五章 CellQuest 軟件 學(xué)習(xí)本章后應(yīng)能夠： ? 用 CellQuest 從流式細(xì)胞儀獲取 3色或 4色樣本 ? 用 CellQuest 從流式細(xì)胞儀分析 3色或 4色樣本 ? 將統(tǒng)計結(jié)果輸出為電子表格 ? 應(yīng)用 Region（區(qū)）和 Gate（門）生成統(tǒng)計 ? 獲取和分析 3色免洗絕對記數(shù)樣本 概述 CellQuest是從流式細(xì)胞儀上進(jìn)行獲取和分析數(shù)據(jù)的通用軟件。 CellQuest軟件功能強(qiáng)大且靈活，并與 Macintosh 的多任務(wù)環(huán)境完全兼容。也可通過 CellQuest調(diào)節(jié)儀器條件，設(shè)定獲取最佳條件并 可將其儲存。 獲取 即收集并儲存流式細(xì)胞儀上數(shù)據(jù)的過程。在獲取前，需用您的樣本來優(yōu)化儀器的條件。 分析 將獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。在分析時，將讀取數(shù)據(jù)文件，然后可畫 Region(區(qū) )、 設(shè)置 marker (標(biāo)尺 )和進(jìn)行統(tǒng)計。在 CellQuest中，可畫單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)點圖、密度圖和等高圖。 從獲取到分析 在 CellQuest中，從獲取到分析的功能允許在數(shù)據(jù)獲取結(jié)束后可從獲取圖轉(zhuǎn)換到分析圖。剛剛獲取的數(shù)據(jù)及在獲取時限定的格式出現(xiàn)在圖中 ，如 region, marker,color 等。 工具板 工具欄可用來畫圖、 region, marker和文字等。點擊選擇。 工具板按鈕 (見圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖：點擊，可畫等高圖，可自定義圖的大小。 2. 選擇：點擊，可選擇一個或多個目標(biāo)，進(jìn)行改大小或移動。 3. 3 維圖：點擊，可畫 3維圖，可自定義圖的大小。 4. 直方圖：點擊，可畫直方圖，可自定義圖的大小。 5. 密度圖：點擊，可畫密度圖，可自定義圖的大小。 6. 點圖：點擊，可畫點圖，可自定義圖的大小。 7. 直 方圖 marker：點擊，可在直方圖上定位 marker 的左邊界和右邊界。 8. 象限 marker：點擊，可在點圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 9. 縮?。狐c擊，然后點擊圖，將放大圖縮小到原大小。 10. 放大：點擊，然后點擊圖，將縮小圖放大到原大小。 11. 矩形 region：點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需 大小。 12. 多邊形 region：點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊形成起始點，然后拖動鼠標(biāo) 畫出多邊形頂點并在起始點處點擊完成多邊形 region 。 13. 直方圖 region：點擊 ，可在直方圖上定位 region 的左邊界和右邊界 14. 橢圓形 region: 點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需大小。 15. 箭頭：點擊，然后在實驗文件中點擊，拖出直線。 16. 文本：點擊，然后點擊定位插入點并編輯文字。 17. 計算器：如果自動復(fù)計算關(guān)閉，點擊進(jìn)行數(shù)據(jù)復(fù)計算。 CellQuest 的文件： FCS list mode數(shù)據(jù)文件 ：是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件（ ）。當(dāng)Aqusition Control 窗口的 Setup前未打 ? 時，進(jìn)行獲取后自動保存的文件格 式。該文件含有從流式細(xì)胞儀獲取的平均 202010000個顆粒數(shù)的數(shù)據(jù)。一個含有 4參數(shù) 10000細(xì)胞數(shù)的數(shù)據(jù)文件若 256道分辨率則文件大小為 45kb，若 1024道分辨率則文件大小為 85kb。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 3 CellQuest實驗文件 ：您設(shè)置的圖、 region、 gate、統(tǒng)計 (statistics)、 markers、文字、顏色 等都將保存。數(shù)據(jù)文件不在實驗文件中保存。 CellQuest實驗文件的菜單由File菜單下 New、 open、 close、 save及 save as等 (同 Microsoft Word)。 注意：實驗文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。若數(shù)據(jù)文件未改變目錄或被刪除，實驗文件可找到其數(shù)據(jù)文件。若二者聯(lián)系喪失，需將丟失的數(shù)據(jù)文件放在其實驗文件同一目錄，實驗文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。若實驗文件的目錄改變，二者的聯(lián)系不會改變，實驗文件仍可找到其數(shù)據(jù)文件。 ? 實驗文件可以后打開以恢復(fù)獲取和分析。 ? 實驗文件可以通用模板儲存以用于常規(guī)獲取和分析。除數(shù)據(jù)文件外所有條件（包括region、 gate、 statistics）都可以通用模板儲存。 ? 實驗文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。 ? 在實驗文件中，有 3種圖：獲取、分析和獲 取到分析。一個實驗文件可含上述 3種圖的組合，但獲取圖不能用來分析，分析圖不能用來獲取。 CellQuest 的儀器控制： 在數(shù)據(jù)收集之前，需用樣本優(yōu)化儀器條件。在優(yōu)化之前需運行 FACSComp.。需為每一組樣本選擇適當(dāng)?shù)膶φ?，如：判斷非特異性結(jié)合的同型對照。在 CellQuest軟件中， 儀器的控制菜 單位于 Cytometer 菜單中。 在用 CellQuest進(jìn)行 3色或 4色分析中，應(yīng)用同型對照和調(diào)補(bǔ)償用對照進(jìn)行儀器條件設(shè) 置。 同型對照包括下列試劑：小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。 它將用 于調(diào)節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設(shè)淋巴細(xì)胞 region、確認(rèn)FL1/FL2/FL3/FL4的設(shè)置及象限設(shè)置。調(diào)補(bǔ)償用對照包括單陽性熒光試劑和同型對照試劑，如：調(diào) FITC補(bǔ)償對照包括下列試劑： CD3－ FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。 調(diào)節(jié)探測器和放大器可使所需信號出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當(dāng)位置。顆粒通過激光束時產(chǎn) 生光 信號，然后轉(zhuǎn)換成電信號，并在點圖上相對應(yīng)于一個道值。依據(jù)所選的分辨率的不同，道 值有從 0－ 25 0－ 1023不同范圍。 探測器 ： 在流式細(xì)胞儀中有二種探測器：光電二極管和光電倍增管 (PMTs)。 光電二 極管對光 的敏感度低于光電倍增管。 光電二極管用于探測 FSC，因為 FSC是強(qiáng)信號?？赏ㄟ^電壓而選擇對 FSC 信號 的不同放 大。 (見圖 2) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 4 E00：將信號放大 1(100)倍。 E01：將信號放大 10(101)倍。 E02: 將信號放大 100(102)倍。 E03: 將信號放大 1000(103)倍。 E1: 將信號放大 (101)倍。 光電倍增管 (PMTs)用于探測 SSC、 FL FL FL3, 因為它們是弱信號。 PMTs的電 壓調(diào)節(jié) 從 150－ 999。當(dāng)電壓上升時，信號增加，數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處?？赏ㄟ^點擊 ?? 來選 擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。 (見圖 2) 放大器 ： 可對信號進(jìn)行微調(diào)。對 FSC、 SSC、 FL FL FL3 可設(shè)置放大模式 和放 大增益。 若 放大模式選擇 Lin(線性 )，放大器的增益 可在 1－ ?？赏ㄟ^ 點擊 ??來選擇或直接拖 動滑 標(biāo)上下移動 (見圖 2)。若放大模式選擇 Log(對數(shù) )，放大器的增益則不可調(diào)節(jié)。 對數(shù)常用 于 分開陰性信號和弱陽性信號。 閾 值 ： 可用來設(shè)置低于該道值的數(shù)據(jù)信號不被處理，只有高于或等于閾值道數(shù)的信號才傳送到計算機(jī)進(jìn)行處理。每次只能有一個參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)。 在免疫表型中， 在 FSC上設(shè)閾值。在 DNA分析中，在 FL2上設(shè)閾值?？赏ㄟ^點擊 ??來選擇或直接拖動 滑標(biāo)上下移動 (見圖 3)。 新版的 CellQuest軟件有雙重閾值設(shè)定。 補(bǔ) 償： 當(dāng)樣本用 2色或 3色熒光染色時需調(diào)節(jié)補(bǔ)償以消除光譜重疊。因為熒光素發(fā)射一定波段的熒光，因此在探測某種特定熒光素的探測器上有來源于另一種熒光素的熒光信號。 FITC主要出現(xiàn)在 FL1探測器上，但也有 部分重疊到 FL2探測器上。 PE主要出現(xiàn)在 FL2探測器上，但也有 部分重疊到 FL1和 FL3探 測器上。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)如下： FL2－％ FL1： 從 FL2探測器上減去重疊的 FL1 FL1－％ FL2： 從 FL1探測器上減去重疊的 FL2 FL3－％ FL2： 從 FL3探測器上減去重疊的 FL2 FL2－％ FL3： 從 FL2探測器上減去重疊的 FL3 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 5 補(bǔ)償調(diào)節(jié)量依賴于探測器的電壓。當(dāng)補(bǔ)償過后的群體與陰性群體一致時，補(bǔ)償調(diào)節(jié)正確。 補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點擊 ??來選擇或 直接拖動滑標(biāo)上下移動。 (見圖 4) 狀 態(tài)： 用來在獲取的任何時候查看流式細(xì)胞儀的運行狀態(tài)，以利解決儀器運行中出現(xiàn)的問題。在菜單位于 Cytometer菜單中 (見圖 5)。 測試脈沖： 在 FACSCalibur中可從 status菜單中選擇 FSC(僅 FSC探測器上產(chǎn)生的信號 )或ALL(所有探測器上產(chǎn)生的信號 )或 OFF。 狀態(tài)： 顯示儀器運行模式 Not Ready: 激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊