【正文】 第六部分 發(fā)酵、釀造工藝實(shí)驗(yàn)第一篇 發(fā)酵工程設(shè)備發(fā)酵工程設(shè)備實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及其各專業(yè)必修、選修表實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)類別面 向 專 業(yè)（以下打“√”為必修，“＊”為選修，數(shù)字為開課學(xué)期）生 科生 技生 工食 品 1小型生物反應(yīng)器的安裝與拆卸2驗(yàn)證√(6） √(5） 2小型連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)裝置的設(shè)計(jì)組建3綜合√(6）√(5）3體積溶氧傳遞系數(shù)的測定3綜合√(6）√(5）4搖床培養(yǎng)確定酵母菌體培養(yǎng)條件8綜合√(6）√(5）5反應(yīng)器培養(yǎng)液的滅菌與接種培養(yǎng)8綜合√(7） 6pH電極、溶氧電極的校正2驗(yàn)證√(7）7生物制品的冷凍干燥6綜合√(7）83M3 機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)4驗(yàn)證√(7）91M3 中試發(fā)酵設(shè)備的操作方法12綜合√(7） 10面包酵母流加培養(yǎng)與分批培養(yǎng)試驗(yàn)24綜合√(7）學(xué) 時(shí) 合 計(jì)727216第二篇 釀造工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)釀造工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及其各專業(yè)必修、選修表實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)類別面 向 專 業(yè)（以下打“√”為必修，“＊”為選修，數(shù)字為開課學(xué)期）生 科生 技生 工食 品 1葡萄酒釀造過程24/14綜合√(6） √(4） 2葡萄酒結(jié)束理化指標(biāo)的測定8/0綜合√(6）√(4）3葡萄酒感官品評4/2綜合√(6）√(4）4乳酸發(fā)酵工藝10/8綜合√(6）√(4）5醋酸發(fā)酵工藝10/8綜合√(6）√(4）學(xué) 時(shí) 合 計(jì)56/325632第一篇 發(fā)酵工程設(shè)備實(shí)驗(yàn)一 小型生物反應(yīng)器的安裝與拆卸機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，又稱發(fā)酵罐，是生物工程設(shè)備的重要組成部分，在微生物工程、酶工程、細(xì)胞工程（細(xì)胞培養(yǎng)）、基因工程（基因工程菌）等科學(xué)研究領(lǐng)域，生物反應(yīng)器均為生物技術(shù)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品必要的設(shè)備。由于小型生物反應(yīng)器進(jìn)料、出料、清洗、電極校正等過程都不同于大型發(fā)酵罐，需要拆卸之后進(jìn)行，因此熟悉生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)及安裝與拆卸操作是正確使用反應(yīng)器的前提。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握生物反應(yīng)器安裝和拆卸的操作規(guī)程，認(rèn)識(shí)和了解生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)與功能。二、基本原理生物反應(yīng)器裝置分兩大部分：、檢測電極；，蒸汽及無菌空氣系統(tǒng)。反應(yīng)器罐體具有可卸上蓋，與罐體是通過橡皮墊圈和螺栓密封。蓋上設(shè)有接種口、空氣進(jìn)口、尾氣出口、各種檢測儀表的插孔、溫度傳感器及溶氧電極和pH電極插口、消泡劑和酸堿液注入口、取樣口、備用口、壓力表、安全閥等；罐底部設(shè)有夾套層，用以熱交換，罐內(nèi)有攪拌槳葉、檔板、空氣分布器；罐外：連接各種傳感器及電極相應(yīng)的控制器，可以自動(dòng)地調(diào)控試驗(yàn)所需的培養(yǎng)條件；連接無菌空氣系統(tǒng)，并配備一臺(tái)自動(dòng)調(diào)控裝置；連接蒸汽發(fā)生器，供滅菌使用。三、實(shí)驗(yàn)裝置3 L 園柱形機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器尾氣圖1 機(jī)械通風(fēng)式攪拌生物反應(yīng)器四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 首先斷開所有電源。2. 卸下可移動(dòng)的所有檢測電極和探頭。3. 擰下螺栓，打開上蓋，檢查培養(yǎng)罐內(nèi)部是否清洗干凈。4. 插入校正完畢的pH電極和氧電極于罐側(cè)面相關(guān)位置，并與放大器連接。5. 加入配置好的培養(yǎng)液，加蓋（由于蓋上的零件較多，必須對準(zhǔn)位置后再蓋上去），并對稱擰緊螺母，直至上蓋被密封固定。6. 將事先清洗干凈并開啟的尾氣過濾器裝于蓋上，安裝安全閥、泡沫傳感器、觀察燈、壓力計(jì)、取樣管，以及滅過菌的無菌空氣過濾器進(jìn)氣管等，剩余的孔洞須用硅膠塞和瞎塞擰緊備用。7. 檢查檢測系統(tǒng)的連接，調(diào)試密閉。8. 作出3 L機(jī)械通風(fēng)攪拌式生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖，注明各裝置名稱。9. 標(biāo)注檢測系統(tǒng)的連接。五、思考題 ？2. pH電極、溶氧電極如何校正？實(shí)驗(yàn)二 小型連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)裝置的設(shè)計(jì)組建連續(xù)培養(yǎng)是在培養(yǎng)器中不斷補(bǔ)充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)，并及時(shí)不斷地以同樣速度排出培養(yǎng)物，理論上對數(shù)生長期可無限延長。不同于分批培養(yǎng)發(fā)酵周期受培養(yǎng)基消耗殆盡的影響，連續(xù)培養(yǎng)使微生物在特定的環(huán)境中持續(xù)保持旺盛生長狀態(tài)，隨著培養(yǎng)基不斷加入，產(chǎn)物不斷生成排出，減少了非發(fā)酵時(shí)間，可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動(dòng)化水平。常用的連續(xù)培養(yǎng)方法有恒濁法與恒化法兩類，恒化連續(xù)培養(yǎng)在研究微生物利用某種底物進(jìn)行代謝的規(guī)律方面被廣泛采用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組建實(shí)驗(yàn)室恒化法培養(yǎng)裝置，有助于對恒化法連續(xù)培養(yǎng)及裝置特性加深理解。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 設(shè)計(jì)組建小型微生物連續(xù)發(fā)酵裝置，掌握連續(xù)發(fā)酵的操作原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 恒化法是通過控制培養(yǎng)基中營養(yǎng)物主要是生長限制因子的濃度來調(diào)控微生物生長繁殖與代謝速度的連續(xù)培養(yǎng)方式。由于培養(yǎng)基質(zhì)加入流量與產(chǎn)物流出的流量保持恒定，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，培養(yǎng)器中各物質(zhì)濃度不隨時(shí)間改變，稱為恒化法，設(shè)計(jì)恒化器培養(yǎng)裝置除滿足液體深層培養(yǎng)所必須的條件外，著重在于滿足上述條件。三、實(shí)驗(yàn)儀器與材料 三角瓶、玻璃槽、玻璃管、棉花、蠕動(dòng)泵、橡膠管、磁力攪拌器、溫度計(jì)、酒精噴燈四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 用實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)計(jì)一套恒化法連續(xù)培養(yǎng)裝置（厭氧培養(yǎng)），并組建安裝。2. 畫出你所組建的簡單連續(xù)培養(yǎng)裝置示意圖并注明各裝置的作用。3. 設(shè)計(jì)出求算單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)比生長速率的實(shí)驗(yàn)步驟及求算181。的過程。五、思考題 ？如何保證培養(yǎng)過程無污染？？實(shí)驗(yàn)三 體積溶氧傳遞系數(shù)的測定單位體積發(fā)酵液氧傳遞系數(shù)kLa可稱為“通氣效率”，不同類型的發(fā)酵罐由于供氧裝置的不同其體積溶氧傳遞系數(shù)不同，kLa大意味著反應(yīng)器供給單位發(fā)酵液的氧的能力強(qiáng)。通過kLa的測定，可了解發(fā)酵過程中氧的傳遞效果的好壞，對提高氧的利用率和增產(chǎn)節(jié)能都有著重要意義。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)運(yùn)用亞硫酸鹽法測定小型生物反應(yīng)器的kLa值。二、 基本原理 用Cu2+ 為催化劑，溶解在水中的氧能立即將水中的SO32氧化成為SO42，其氧化反應(yīng)的速度在很大范圍內(nèi)與SO32的濃度幾乎無關(guān)。因此氧化速率是控制氧化反應(yīng)的因素。其反應(yīng)式如下：2Na2SO3+ O2 2Na2SO4剩余的Na2SO3與過量的碘作用Na2SO3+I2+H2O Na2SO4+2HI剩余的I2用標(biāo)定的Na2S2O3溶液滴定。標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3溶液的用量取決于溶解氧的量。每1 ml溶氧可氧化2 mol Na2SO3，也就消耗掉4 mol Na2S2O3。因此每消耗1 mol Na2S2O3（與對比樣的體積差）必有1/4 mol溶氧在通氧過程中參與反應(yīng)。 則：溶氧當(dāng)量Nv=KLa（c*c）KLa= Nv/三、 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 3 L生物反應(yīng)器、250 ml三角瓶、25 ml移液管、滴定臺(tái)、滴定管、Na2SO3 、CuSO碘溶液、Na2S2O3四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1. g g CuSO4。按實(shí)驗(yàn)一方法打開發(fā)酵罐，將1 L自來水加入到發(fā)酵罐中，開始攪拌，依次加入Na2SO3晶體和CuSO4，攪拌使完全溶解。取樣10 ml，作為未通氣的對照組，注入預(yù)先準(zhǔn)備好的過量的碘溶液中。2. 安裝好發(fā)酵罐，檢查使密閉。開閥通氣，打開攪拌器到常用轉(zhuǎn)速。氣閥開啟迅速調(diào)至預(yù)定空氣流量。當(dāng)罐內(nèi)溶液中有氣泡冒出時(shí)，開始計(jì)時(shí)，作為通氧時(shí)間的開始。3 .氧化時(shí)間持續(xù)1020 min，到預(yù)定時(shí)間停止通氣和攪拌，準(zhǔn)確記錄通氧時(shí)間。 4. 取樣10 ml作為樣液，注入預(yù)先準(zhǔn)備好的過量的與對照組所注入的相同量的碘溶液中。5. 在對照組與樣液中分別加入淀粉溶液3滴作為指示劑，分別用標(biāo)定的Na2S2O3溶液滴定，至碘溶液中藍(lán)色消失。6. 分別記錄對照組與樣液滴定所消耗Na2S2O3溶液的量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果滴定前讀數(shù)滴定后讀數(shù)滴定消耗量△V對照液滴定V1=樣液滴定V2=六、思考題 ？？實(shí)驗(yàn)四 搖床培養(yǎng)確定酵母菌體培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)(Orthogonal experimental)是研究多因素多水平的試驗(yàn)方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可大幅度減少試驗(yàn)工作量，因而正交試驗(yàn)在很多領(lǐng)域的研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)即是利用正交試驗(yàn)的方法選擇酵母最佳培養(yǎng)基以掌握正交試驗(yàn)的方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過搖瓶法確定發(fā)酵周期，學(xué)習(xí)應(yīng)用正交法確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配比。二、實(shí)驗(yàn)原理 。生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。由于酵母在液體深層通氣發(fā)酵過程中是以均一混濁液的狀態(tài)存在的，可采用直接比濁法進(jìn)行測定。搖瓶培養(yǎng)中通過定期取樣測定酵母濃度，找出對數(shù)生長末期確定為培養(yǎng)終點(diǎn)。在碳源、氮源、無機(jī)鹽初步確定的前提下，通過四因素三水平正交試驗(yàn)，可判斷四因素組合時(shí)各因素的最佳濃度，從而確定最佳培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)儀器與材料 1. 實(shí)驗(yàn)儀器：全恒溫振蕩培養(yǎng)箱，分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴槽、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、天平；250 ml三角瓶、50 ml三角瓶、移液管（移液槍）。2. 試驗(yàn)材料：葡萄糖、蔗糖、酵母膏、KH2PO4。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1. 養(yǎng)基的配制(見表1，2) 表1 正交表試驗(yàn)設(shè)計(jì) （100 ml）因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 2 3 表2 正交表實(shí)驗(yàn)方案 編號(hào)葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD）0h 12h24h36h48h60h1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) K1K2K3極差R2. 取250ml三角瓶將上述培養(yǎng)基配制200 ml，取6個(gè)50 ml三角瓶各裝入培養(yǎng)基10 ml，及剩余的培養(yǎng)基（用于測定時(shí)稀釋，當(dāng)OD值小于或大于）于121 ℃下滅菌30 min，冷卻。（制備無菌水）3. ml（接種量為5％），置于28 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。4. 測OD值：將接種0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同時(shí)間的菌懸液搖均勻后于560 nm波長、1 cm比色皿中測定OD值。比色測定時(shí)，用以未接種的培養(yǎng)基作空白對照，并將OD值填入表中，最終確定最佳培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵時(shí)間。 5. 作各因素水平的K圖。6. 根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)判定發(fā)酵時(shí)間及最佳培養(yǎng)基配比。五、思考題 1. 為什么要作K圖？如果實(shí)驗(yàn)繼續(xù)深入，應(yīng)該改變那些因素水平，為什么？？有何意義？實(shí)驗(yàn)五 反應(yīng)器培養(yǎng)液的滅菌與接種培養(yǎng)小型臺(tái)式玻璃生物反應(yīng)器置于高壓鍋中滅菌，而金屬制生物反應(yīng)器的滅菌是采用夾套層蒸汽加熱滅菌的方式進(jìn)行的。由于結(jié)構(gòu)的差異小型生物反應(yīng)器滅菌與大型發(fā)酵罐滅菌操作有一定的差別，小型生物反應(yīng)器的上蓋上有眾多的電極接口，需防止蒸汽打濕；蒸汽的進(jìn)出口路線也有所不同，需保證蒸汽進(jìn)出暢通。通過實(shí)際操作熟悉滅菌的過程。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 學(xué)習(xí)和掌握生物反應(yīng)器滅菌與接種培養(yǎng)的操作，認(rèn)識(shí)和掌握運(yùn)用現(xiàn)代化反應(yīng)器的操作規(guī)程及方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 將反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的溫度升至121 ℃，以達(dá)到滅菌的效果，滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至培養(yǎng)溫度后，即可接種培養(yǎng)。接種時(shí)，嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，避免雜菌污染。三、實(shí)驗(yàn)儀器與材料 5L升生物反應(yīng)器、蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)器控制臺(tái)、三角瓶； 菌種：酵母菌；培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，無機(jī)鹽。四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法1 .滅菌：在反應(yīng)器安裝就序后，接通電源，打開控制臺(tái)總開關(guān)，開啟冷卻水閥，分別按下溫度、pH、溶解氧、攪拌器開關(guān)鍵，調(diào)節(jié)攪拌器轉(zhuǎn)速約120 rpm， 調(diào)整滅菌時(shí)間（30 min），設(shè)置滅菌溫度（121 ℃），同時(shí)，按下滅菌開關(guān)鍵。使電加熱器對罐底夾套層進(jìn)行加熱，罐內(nèi)溫度逐漸上升，待溫度升至105 ℃左右時(shí)，關(guān)閉廢氣出口閥。溫度繼續(xù)上升至滅菌溫度，自動(dòng)保溫至設(shè)定時(shí)間后，由冷卻水自動(dòng)冷卻至設(shè)置的發(fā)酵溫度。2. 培養(yǎng)條件的確定：通人反應(yīng)器的空氣是從空壓機(jī)經(jīng)空氣過濾器而成無菌空氣，再由空氣分布管送入滅過菌的培養(yǎng)罐內(nèi)。在控制臺(tái)上，設(shè)定所需的攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、pH值，并將空氣流量計(jì)的流量調(diào)至確定值。：將事先培養(yǎng)好的培養(yǎng)液（在三角瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以無菌操作方式倒入已滅過菌的帶有插在保險(xiǎn)管套筒內(nèi)的注射針及軟管的三角瓶內(nèi)）由接種口接入罐內(nèi)，接種時(shí)，要在接種口的隔膜周圍放上浸有酒精的棉花或用13 ml乙醇覆蓋，點(diǎn)燃，以產(chǎn)生上升的氣流來防止雜菌污染。接種塞從無菌筒內(nèi)取出，然后將接種針穿過火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，擰緊