細胞化學染色ppt課件(2)(已修改)
2025-05-16 12:01 本頁面
【正文】 臨床血液學和血液學檢驗 第四章 造血檢驗的基本方法 華中科技大學同濟醫(yī)學院 醫(yī)學檢驗系 陳 萬 新 第二節(jié) 細胞化學染色 ? 細胞化學（或組織化學）是在細胞形態(tài)學的基礎(chǔ)上運用無機化學、有機化學或生物化學等技術(shù)研究細胞在發(fā)育、增殖分化過程中的主要化學成分的定位、定量及代謝功能狀態(tài)的學科，是細胞形態(tài)學的重要組成部分。 ? 細胞化學染色一般包括固定、顯示、復染等步驟。 ? 主要用于： ? 顯示細胞或組織的酶、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、無機鹽（如鐵）等化學成分的含量及分布狀況； ? 研究細胞組織來源及分化程度；為疾病的診斷、鑒別診斷及治療提供重要的依據(jù)。 中性粒細胞堿性磷酸酶染色（ NAP） ? ㈠ .原理 ： ? 方法一（偶氮偶聯(lián)法）：在 ~液中，細胞中的堿性磷酸酶能將底物磷酸萘酚鈉水解，生成 a萘酚和磷酸鈉，再以穩(wěn)定的重氮鹽與萘酚偶聯(lián)生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于細胞漿中。 試劑 ： ? ： 1∶ 9福爾馬林乙醇液 ， 即 40％ 甲醛溶液 （ 福爾馬林 ） 10ml加無水乙醇 90ml混合即得 。 ? 2 . a磷酸萘酚鈉溶液： 100mg a磷酸萘酚鈉溶于（ ～ ） Tris緩沖溶液中 ， 混勻后4℃ 保存 。 ? （ mol/L ） ： Tris粉 （ 三羥甲基氨基甲烷 ） 100ml蒸餾水中 ， 加濃鹽酸 （ ） 。 ? （ 臨用時現(xiàn)配 ） ：取 a磷酸萘酚鈉溶液 37oC水溫箱中預熱 5分鐘 ， 加堅固籃 BB鹽 ， 混勻即可 。 ? 染色步驟 ： ? 干燥涂片 （ 觀察片及陽性對照片 ） ， 滴加固定劑布滿血膜固定 5秒鐘 ， 流水沖洗 ， 待干或濾紙吸干 。 ? 滴加作用液室溫下 （ 或 37oC） 染色 15～ 20分鐘 ，流水沖洗 ， 待干 。 ? 中性紅溶液復染 3分鐘 ， 流水沖洗 ， 干后鏡檢 。 ? 結(jié)果判斷 ： ? 陽性反應(yīng)呈藍黑色顆粒狀 ， 定位于細胞漿中 。 ? 計數(shù)方法 ： ? 按堿性磷酸酶活性強弱 ， 分為 5級 (0－ IV或 0－ ++++) 。 ? 0級 0 胞漿呈原色 ， 無顆粒 。 ? Ⅰ 級 + 胞漿呈淺灰色 ， 陽性顆粒占胞漿的 25%－ 50%。 ? Ⅱ 級 ++ 陽性顆粒約占胞漿面積的 50%－ 75%。 ? III級 +++ 陽性顆粒占胞漿面積的 75%－ 100%。 ? Ⅳ 級 ++++ 胞漿充滿藍黑色致密的陽性顆粒 ， 占胞漿面積的 l00%， 甚至遮蓋胞核 。 ? 每例的血片 ， 均計數(shù) 100個中性粒細胞 （ 桿狀核及分葉核粒細胞 ） ， 求出 NAP陽性細胞的百分比 (陽性率 )， 并按酶活性的強弱不同 ， 求得陽性指數(shù) (積分 )。 0級 0 胞漿呈原色，無顆粒。 Ⅰ 級 + 胞漿呈淺灰色，細小藍黑色顆粒占胞漿面積的 25%～50%。 Ⅰ 級 + 胞漿呈淺灰色，細小藍黑色顆粒占胞漿面積的 25%～50%。 Ⅱ 級 ++ 胞漿呈棕色片狀沉淀，小到中等顆粒約占胞漿面積的 50%～ 75%。 Ⅱ 級 ++ 胞漿呈棕色片狀沉淀 ， 小到中等顆粒約占胞漿面積的 50%－ 75%。 ? Ⅲ 級 +++ 胞漿充滿棕黑色沉淀，分布均勻，中到大顆粒占胞漿面積的 75%－ 100%。 Ⅲ 級 +++ 胞漿充滿棕黑色沉淀，分布均勻，中到大顆粒占胞漿面積的 75%－ 100%。 Ⅳ 級 ++++ 胞漿充滿深黑色致密的團塊狀沉淀，甚至遮蓋胞核，中到大顆粒占胞漿面積的 l00%。 ? 注意事項 ： ? 1. 重氮鹽以堅固籃 BB鹽為最佳 ， 其次為堅固籃 B鹽及堅固籃 RR鹽 。 ? 2. 也可用新鮮配制的六偶氮副品紅為重氮鹽 ， 配方為：10ml a磷酸萘酚鈉溶液中加六偶氮副品紅 50μl， 其NAP陽性反應(yīng)呈紅色顆粒狀 。 六偶氮副品紅： 4%副品紅 （ 2N鹽酸 ） 溶液與 4%亞硝酸鈉溶液 1∶ 1混合 ， 靜置1min。 ? 3. 重氮鹽應(yīng)適量 ， 過量會導致染色失敗 ， 出現(xiàn)假陰性；量不足 ， 則陽性反應(yīng)較弱 。 ? 4. 工作液配好后應(yīng)立即使用 （ 5min以內(nèi) ） 。 ? 需用感染發(fā)熱病人或正常人外周血涂片作為陽性對照。 ? ㈡ .正常分布 ： ? 陽性反應(yīng)主要見于成熟中性粒細胞 （ 桿狀及分葉粒細胞 ） 中 ， 反應(yīng)結(jié)果以陽性率和積分值報告 。 ? 正常參考值 ：成人 NAP陽性率 ％ （ 20%－ 40%） ，積分 （ 20－ 80） 。 ? ㈢ .臨床意義 ： ? ⒈ 類白血病反應(yīng)與慢性粒細胞白血病的鑒別診斷：前者顯著增高 ， 陽性率常達 90%以上 ， 積分常高于 200分；后者顯著減低 ， 積分可為 0。 ? ⒉ 細菌性化膿性感染時 ， 積分顯著增高；病毒性感染時多為正?；蛏缘?。 ? ⒊ 淋巴細胞白血病時常增高；單核細胞白血病時正?；蛟龈?；慢性中性粒細胞白血病時增高 ， 其它各型粒細胞白血病時減低；白血病伴感染時增高 。 ? ⒋ 真性紅細胞增多癥 、 骨髓纖維化 、 再生障礙性貧血時增高 ， PNH時常減低 。 ? ，如骨腫瘤、消化道腫瘤的腫瘤細胞堿性磷酸酶常為較強陽性反應(yīng)。 酸性磷酸酶染色（ ACP） ? 方法一： Gomori硫化鉛法 ? 原理： ? 在酸性條件下（ ） 酸性磷酸酶能將底物（甘油磷酸鈉）水解，產(chǎn)生－ PO43， 與 Pb2+作用生成磷酸鉛沉淀，定位于胞漿中酶活性存在處，再與硫化銨作用，生成棕黑色的硫化鉛沉淀。 ? 試劑： ? ： 40%甲醛溶液 （ 福爾馬林 ） 。 ? 2. 工作液配制： ? 蒸餾水 37ml ? ? （ 5%） 硝酸鉛 1ml ? （ %） β－ 甘油磷酸鈉 2ml ? （ 臨用時現(xiàn)配 ） ：取硫化銨水劑 50ml。 ? ： 1g甲基綠溶于 50ml蒸餾水中。 ? 染色步驟： ? 1. 新鮮干燥涂片甲醛蒸氣固定 5～ 10min， 流水沖洗5min， 待干 。 ? 2. 入工作液 37℃ 孵育 2～ 3h， 流水沖洗數(shù)次 。 ? 3. 稀硫化銨溶液浸泡 2～ 3min， 流水沖洗 。 ? 4. 甲基綠溶液復染 10min， 流水沖洗 ， 干后鏡檢 。 ? 結(jié)果判斷： ? 陽性反應(yīng)呈棕黃色至棕黑色定位于胞漿中。 ? 注意事項： ? 1. 固定劑以甲醛蒸氣為
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