【正文】 1 上海水產(chǎn)大學(xué)生命學(xué)院 周平凡 光鏡與電鏡技術(shù) 2 第二部分 :電子顯微鏡技術(shù) （電子顯微鏡和電子顯微術(shù)的總稱） 3 一、概 述 ： 第一章 :電子顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu) 第一節(jié) :幾個常用的基本概念 第二節(jié) :透射電子顯微鏡 第三節(jié) :掃描電子顯微鏡 第四節(jié) :其他類型的電子顯微鏡 第二部分 :電鏡技術(shù) 4 第二章 :超薄切片技術(shù) 第一節(jié) :取材 第二節(jié) :固定和固定劑 第三節(jié) :脫水 第四節(jié) :浸透和包埋 第五節(jié) :超薄切片 第二部分 :電鏡技術(shù) 5 第三章 :電子染色技術(shù) 第一節(jié) :電子顯微鏡標(biāo)本的正染色 第二節(jié) :電子顯微鏡標(biāo)本的負(fù)染色 第三節(jié) :半薄切片染色 第二部分 :電鏡技術(shù) 6 第四章 :掃描電鏡生物樣品制備技術(shù) 第一節(jié) :取材和標(biāo)本的預(yù)處理 第二節(jié) :生物樣品的干燥 第三節(jié) :生物樣品的導(dǎo)電法 第二部分 :電鏡技術(shù) 7 一、概 述 8 9 透射電鏡 TEM（ transmission electron microscope） 觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 掃描電鏡 SEM（ scanning electron microscope) 觀察組織或細(xì)胞表面的立體結(jié)構(gòu) 透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 電子顯微鏡的分類： 10 電子顯微鏡照片 透射電子顯微鏡拍攝的照片 掃描電子顯微鏡拍攝的照片 細(xì)胞核 紅血球 11 一、概 述 12 一、概 述 13 電鏡具有很高的分辨本領(lǐng) ,能觀察極微小的結(jié)構(gòu)。但是電鏡不能直接觀察天然狀態(tài)下的生物標(biāo)本 ,必須通過各種技術(shù)將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡生物樣品 ,才能放入電鏡進行觀察 ,這些電鏡樣品制備技術(shù)稱為電子顯微術(shù)。 電鏡能在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用 ,在很大程度上是由于電子顯微術(shù)的改進和發(fā)展。電子顯微術(shù)種類很多 ,這里僅介紹幾種常用的技術(shù)。 一、概 述 14 通過多種電子顯微術(shù)的配合 能了解生物樣品的化學(xué)組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的關(guān)系。 電鏡技術(shù) 無論在生物技術(shù)的基礎(chǔ)研究中、還是在臨床醫(yī)學(xué) , 都有著廣闊的發(fā)展前景。 一、概 述 15 一、電子顯微鏡的概況 透射電鏡的點分辨率達到了 23A,晶格分辯率已達到 1A左右 ,已使人們能用電鏡直接觀察原子象； 除透射電鏡外 ,發(fā)展了多種電鏡 ,如掃描電鏡、掃描透射電鏡、分析電鏡等 ,使我們能對樣品進行綜合研究。 一、概 述 16 （一）透射電鏡 透射電鏡 是利用電子射線穿透樣品后放大而成像的一種電鏡。 主要優(yōu)點 分辨率高 ,可用來觀察組織和細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)以及微生物和生物大分子的全貌 ,在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用最為廣泛。 加速電壓 一般透射電鏡（加速電壓小于 120KV） ,高壓透射電鏡（加速電壓在 120KV與 500KV之間） ,超高壓透射電鏡（加速電壓大于 500KV）。 一、概 述 17 一、概 述 18 二 、 電鏡成象的原理 19 一、概 述 20 一般透射電鏡：就是最常用的 100KV電鏡。 這種電鏡的分辨率高 (點 3A,晶格 ),但穿透本領(lǐng)小 ,觀察樣品必須很薄 ,如小于 超薄切片、負(fù)染樣品和復(fù)型膜等。 這種電鏡在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已相當(dāng)普及。 一、概 述 21 超高壓透射電鏡：已有 500KV、 1000KV和 3000KV的超高壓電鏡。 這種電鏡具有穿透能力強、輻射損傷小、可以配備環(huán)境樣品室及進行各種動態(tài)觀察等優(yōu)點 ,分辨率也已達到或超過 100KV電鏡的水平。 在超高壓電鏡上附加充氣樣品室 ,使人們有可能觀察活細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化 ,對生物醫(yī)學(xué)工作者很有吸引力。這種電鏡龐大而且昂貴 ,遠(yuǎn)非一般實驗室所能裝備。 一、概 述 22 東京大學(xué)工學(xué)院 125萬伏超高壓電鏡（ JEOL– ARM– 1250）， 該電鏡價值 1000萬美元，有三層樓那么高，是世界上精確度最高的電鏡之一，主要用于原子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的特性研究。 23 24 25 該電鏡的開放管理時，該電鏡的技術(shù)工作委員會主任市野漱告訴我們，他的電鏡每天 24小時向“ 全世界 ” 開放。 盡管是高精度特大型電鏡，他們?nèi)匀粚嵭杏脩艚?jīng)培訓(xùn)合格后自行上機的開放模式。 原則上，電鏡實行測試收費管理，但他們電鏡開放的重點是從事高水平的測試服務(wù)與科學(xué)研究。 26 用戶的樣品不需要在這樣高水平的電鏡上測試，即便是付費，他們也不予測試，因為這等于是浪費了高水平的資源。相反，如果用戶提出的樣品或課題有很高的學(xué)術(shù)、科學(xué)技術(shù)價值，即便資費不夠，他們也會主動接受。每年提供 3％的運行費用。 27 可以根據(jù)用戶項目水平的高低，他們可以采用合作方式開展測試研究，甚至免費提供測試和研究。正由于他們有這樣的開放與合作原則，多年來，他們的電鏡在高水平研究方面發(fā)揮了重要作用，取得了許多世界一流的學(xué)術(shù)成果。 28 用戶提出的樣品和研究有很高的價值，他們甚至可以提供幾個月的免費食宿和測試，開展合作研究。正因為如此，他們也做出了很多高水平的成果，在全世界的同行中享有很高的知名度。 29 國外實驗室倡導(dǎo) 電子顯微鏡室 對外開放： 高年級學(xué)生 研究生 博士生 科研人員 30 31 32 UCLA納米系統(tǒng)實驗室 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 （二）掃描電鏡 掃描電鏡是利用電子射線轟擊樣品表面 ,引起二次電子等信號的發(fā)射 ,經(jīng)檢測裝置接收后成像的一種電鏡。 特點是景深長 ,所獲得的圖象立體感強 ,可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。 在生物醫(yī)學(xué)中 ,采用不同的樣品制備技術(shù)可觀察不同的結(jié)構(gòu) ,如用臨界點干燥方法可觀察樣品的表面形貌； 用冷凍割裂方法可觀察樣品割裂面的結(jié)構(gòu) ,用鑄型方法可觀察管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。 一、概 述 51 一、概 述 52 一般掃描電鏡 目前一般商品掃描電鏡采用熱發(fā)射電子槍 ,分辯率為 60A左右 ,若采用六棚化鑭電子槍 ,分辨率可提高到 4050A。 這種電鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也已相當(dāng)普及。 一、概 述 53 一、概 述 54 一、概 述 55 （四）掃描透射電鏡 掃描電鏡中電子射線作用于樣品后 ,其中一部分電子可透過樣品成為透射電子 ,將透過樣品的透射電子和散射電子用檢測器接收成像 ,即成為掃描透射電鏡。 這種電鏡一般用場發(fā)射電子槍 ,兼有透射電鏡、掃描電鏡和分析電鏡的特點 ,能觀察較厚的樣品 ,分辨本領(lǐng)和成象質(zhì)量都很好 ,是近年來電鏡技術(shù)的最大改進之一。 一、概 述 56 超薄切片技術(shù) 由于電子射線穿透本領(lǐng)很差 ,對厚于 很難透過。因此 ,必須把生物標(biāo)本切得很薄才能在透射電鏡下觀察。 超薄切片技術(shù)就是通過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟 ,將生物標(biāo)本切成薄于 備技術(shù) ,用于生物組織的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)研究。 超薄切片技術(shù)是所有電鏡生物樣品制備技術(shù)中最常用、最基本的一種技術(shù)。 （一）與透射電鏡有關(guān)的電子顯微術(shù) 57 負(fù)染色技術(shù) 利用電子密度比標(biāo)本高的重金屬鹽（如磷鴿酸納、醋酸鈾等）將生物標(biāo)本包圍起來 ,增強背景散射電子的能力以提高反差 ,在黑暗的背景下顯示標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu) ,稱負(fù)染色技術(shù)。 這一技術(shù)操作簡便 ,主要用于顆粒狀標(biāo)本（如細(xì)菌、病毒、分離細(xì)胞