cdna測(cè)序和表達(dá)譜研究(已修改)
2025-05-11 02:35 本頁(yè)面
【正文】 cDNA測(cè)序和表達(dá)譜研究 一、 cDNA測(cè)序 cDNA： 與信使 RNA互補(bǔ)的 DNA， 代表了基因的生物學(xué)信息。 基因：約占總序列的 3％ 5％ 1991年， Venter等： 提出大規(guī)模 cDNA測(cè)序研究戰(zhàn)略 建立了表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tag， EST)技術(shù)。 EST： 長(zhǎng)度為 300～ 500bp的部分 cDNA 對(duì)人類基因轉(zhuǎn)錄圖的制作、全長(zhǎng)基因的克隆、基因表達(dá)譜的研究等有重要作用。 公共數(shù)據(jù)庫(kù) GenBank( dbEST) UniGene： 為了弄清 EST間的關(guān)系，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (NCBl)根據(jù) EST相似性比較進(jìn)行聚類分析，形成數(shù)據(jù)庫(kù) UniGene ( UniGene) 當(dāng)前 cDNA測(cè)序的趨勢(shì) : 由對(duì) EST的隨機(jī)測(cè)序， 轉(zhuǎn)向全長(zhǎng) cDNA的克隆和測(cè)序。 全長(zhǎng) cDNA 是功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)， 有功能意義的全長(zhǎng) cDNA可以申請(qǐng)專利， 因此，除研究部門外，大藥廠和生物技術(shù)公司也投入重金進(jìn)行研究和搶占專利。 目前大部分的全長(zhǎng)基因有待于克隆。 隨著人類基因組 DNA測(cè)序的快速進(jìn)展，眾多 EST可供利用，生物信息學(xué)手段的增多和 cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)的完善，使得能夠獲得轉(zhuǎn)錄物較長(zhǎng)的全長(zhǎng) cDNA和低轉(zhuǎn)錄基因。 目前，美國(guó) NIH啟動(dòng)了全長(zhǎng) cDNA計(jì)劃 —哺乳動(dòng)物基因采集計(jì)劃 (Mammalian Gene Collection Project) ， 加之其他國(guó)家的加入，大大加快了全長(zhǎng) cDNA的識(shí)別和克隆工作。 中國(guó)的人類基因組計(jì)劃起步較晚，但堅(jiān)持 “ 有所為，有所不為 ” 的原則，充分利用自己的資源優(yōu)勢(shì)和研究基礎(chǔ)，提出對(duì)特殊組織如造血細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胚胎器官等 ,或疾病如白血病、肝癌等進(jìn)行大規(guī)模 EST測(cè)序 ,進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，同時(shí)完成 1％人類全長(zhǎng) cDNA的識(shí)別和克隆任務(wù)。 (一 )大規(guī)模 EST測(cè)序流程 并非簡(jiǎn)單個(gè)別 cDNA測(cè)序的累加， 是現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代管理方法的結(jié)合， 是生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的結(jié)合。 大規(guī)模 EST測(cè)序： 多采用流水線作業(yè)及計(jì)算機(jī)輔助管理系統(tǒng)。 主要步驟： 1)cDNA文庫(kù)構(gòu)建 2)DNA測(cè)序 3)信息處理和管理 4)生物信息學(xué)分析 1. cDNA文庫(kù)構(gòu)建 研究目的不同 —采用不同的 cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法。 ① 表達(dá)譜分析：常規(guī)的 cDNA文庫(kù)，如： oligodT引物定向克隆 cDNA文庫(kù)或隨機(jī)引物法構(gòu)建 cDNA文庫(kù)； ② 獲得更多的全長(zhǎng) cDNA： 構(gòu)建全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)，如： smartPCR和 oligoPCR； ③ 增加 EST種類：均一化 (normalized)cDNA文庫(kù)； ④ 克隆不同狀態(tài) (藥物處理的不同時(shí)相、不同病理及疾病的不同發(fā)展階段等 )的相關(guān)基因：減式 cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法。 (1)oligodT引物定向克隆 cDNA文庫(kù) 最常用、大多數(shù) cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法； 多數(shù) EST來自該文庫(kù)。 主要步驟： RNA和 mRNA抽提， 以 mRNA為模板用 oligodT作反轉(zhuǎn)錄引物合成 cDNA第一鏈， 在 DNA聚合酶 I作用下合成第二鏈， 加上接頭后定向裝入 λ 噬菌體。 (2)CapFinderPCR/oligoPCR文庫(kù) 主要特點(diǎn)： 利用 mRNA 5’帽狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)引物， 該引物含有 oligo(G)以對(duì)應(yīng)于帽狀結(jié)構(gòu)的脫氧胞嘧啶，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)易于合成含有全長(zhǎng)的第一鏈 cDNA， 用 5’和 3’引物 (oligodT)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得雙鏈 DNA， 裝入 λ 噬菌體。 該種文庫(kù)含有較高比例的全長(zhǎng) cDNA， 也適于樣本量較少的組織構(gòu)建 cDNA文庫(kù)。 (3)均一化 cDNA文庫(kù) 特點(diǎn)：將低豐度表達(dá)基因識(shí)別和克隆出來 各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所采取的具體方法不同，效果也不一致。 主要目的： 減少測(cè)序量，盡可能識(shí)別更多的基因尤其是低轉(zhuǎn)錄基因。 構(gòu)建文庫(kù)時(shí)： 通過控制 PCR反應(yīng)減少高豐度基因擴(kuò)增， 或采用自身 mRNA乳膠吸附方法減少高豐度 mRNA； 構(gòu)建 cDNA后， 也可以通過雜交的方法去除部分高表達(dá)的基因， 或者通過循環(huán)雜交、吸附的方法去除已經(jīng)測(cè)序基因。 (4)減式 cDNA文庫(kù) 根據(jù)研究目的，可采用不同的減式方法。 如要獲得藥物處理后上調(diào)的基因， 采用前向 (forward)減式方法，即用藥物處理前 mRNA雜 交或吸附藥物處理后的 mRNA； 反之，要獲得藥物處理后下調(diào)的基因， 則采用后向 (backward)減式方法。 缺點(diǎn)：該方法尚不完善和不穩(wěn)定， 所獲得的結(jié)果需 Northern印跡法證實(shí)， 并且插入子的片段較短，缺少 5’或 3’端， 對(duì)低豐度 mRNA效果不佳。 目前，多主張將減式方法和均一化方法
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