cdna測序和表達(dá)譜研究(已修改)
2025-05-11 02:35 本頁面
【正文】 cDNA測序和表達(dá)譜研究 一、 cDNA測序 cDNA： 與信使 RNA互補的 DNA， 代表了基因的生物學(xué)信息。 基因：約占總序列的 3％ 5％ 1991年， Venter等： 提出大規(guī)模 cDNA測序研究戰(zhàn)略 建立了表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tag， EST)技術(shù)。 EST： 長度為 300～ 500bp的部分 cDNA 對人類基因轉(zhuǎn)錄圖的制作、全長基因的克隆、基因表達(dá)譜的研究等有重要作用。 公共數(shù)據(jù)庫 GenBank( dbEST) UniGene： 為了弄清 EST間的關(guān)系，美國國立生物技術(shù)信息中心 (NCBl)根據(jù) EST相似性比較進(jìn)行聚類分析，形成數(shù)據(jù)庫 UniGene ( UniGene) 當(dāng)前 cDNA測序的趨勢 : 由對 EST的隨機測序， 轉(zhuǎn)向全長 cDNA的克隆和測序。 全長 cDNA 是功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)， 有功能意義的全長 cDNA可以申請專利， 因此，除研究部門外，大藥廠和生物技術(shù)公司也投入重金進(jìn)行研究和搶占專利。 目前大部分的全長基因有待于克隆。 隨著人類基因組 DNA測序的快速進(jìn)展，眾多 EST可供利用，生物信息學(xué)手段的增多和 cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)的完善，使得能夠獲得轉(zhuǎn)錄物較長的全長 cDNA和低轉(zhuǎn)錄基因。 目前，美國 NIH啟動了全長 cDNA計劃 —哺乳動物基因采集計劃 (Mammalian Gene Collection Project) ， 加之其他國家的加入，大大加快了全長 cDNA的識別和克隆工作。 中國的人類基因組計劃起步較晚，但堅持 “ 有所為，有所不為 ” 的原則，充分利用自己的資源優(yōu)勢和研究基礎(chǔ)，提出對特殊組織如造血細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胚胎器官等 ,或疾病如白血病、肝癌等進(jìn)行大規(guī)模 EST測序 ,進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，同時完成 1％人類全長 cDNA的識別和克隆任務(wù)。 (一 )大規(guī)模 EST測序流程 并非簡單個別 cDNA測序的累加， 是現(xiàn)代生物技術(shù)和現(xiàn)代管理方法的結(jié)合， 是生物學(xué)與計算機科學(xué)的結(jié)合。 大規(guī)模 EST測序： 多采用流水線作業(yè)及計算機輔助管理系統(tǒng)。 主要步驟： 1)cDNA文庫構(gòu)建 2)DNA測序 3)信息處理和管理 4)生物信息學(xué)分析 1. cDNA文庫構(gòu)建 研究目的不同 —采用不同的 cDNA文庫構(gòu)建方法。 ① 表達(dá)譜分析：常規(guī)的 cDNA文庫，如： oligodT引物定向克隆 cDNA文庫或隨機引物法構(gòu)建 cDNA文庫； ② 獲得更多的全長 cDNA： 構(gòu)建全長 cDNA文庫，如： smartPCR和 oligoPCR； ③ 增加 EST種類：均一化 (normalized)cDNA文庫； ④ 克隆不同狀態(tài) (藥物處理的不同時相、不同病理及疾病的不同發(fā)展階段等 )的相關(guān)基因：減式 cDNA文庫構(gòu)建方法。 (1)oligodT引物定向克隆 cDNA文庫 最常用、大多數(shù) cDNA文庫構(gòu)建的方法； 多數(shù) EST來自該文庫。 主要步驟： RNA和 mRNA抽提， 以 mRNA為模板用 oligodT作反轉(zhuǎn)錄引物合成 cDNA第一鏈， 在 DNA聚合酶 I作用下合成第二鏈， 加上接頭后定向裝入 λ 噬菌體。 (2)CapFinderPCR/oligoPCR文庫 主要特點： 利用 mRNA 5’帽狀結(jié)構(gòu)設(shè)計引物， 該引物含有 oligo(G)以對應(yīng)于帽狀結(jié)構(gòu)的脫氧胞嘧啶，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時易于合成含有全長的第一鏈 cDNA， 用 5’和 3’引物 (oligodT)進(jìn)行 PCR擴增獲得雙鏈 DNA， 裝入 λ 噬菌體。 該種文庫含有較高比例的全長 cDNA， 也適于樣本量較少的組織構(gòu)建 cDNA文庫。 (3)均一化 cDNA文庫 特點：將低豐度表達(dá)基因識別和克隆出來 各個實驗室所采取的具體方法不同，效果也不一致。 主要目的： 減少測序量，盡可能識別更多的基因尤其是低轉(zhuǎn)錄基因。 構(gòu)建文庫時： 通過控制 PCR反應(yīng)減少高豐度基因擴增， 或采用自身 mRNA乳膠吸附方法減少高豐度 mRNA； 構(gòu)建 cDNA后， 也可以通過雜交的方法去除部分高表達(dá)的基因， 或者通過循環(huán)雜交、吸附的方法去除已經(jīng)測序基因。 (4)減式 cDNA文庫 根據(jù)研究目的，可采用不同的減式方法。 如要獲得藥物處理后上調(diào)的基因， 采用前向 (forward)減式方法，即用藥物處理前 mRNA雜 交或吸附藥物處理后的 mRNA； 反之，要獲得藥物處理后下調(diào)的基因， 則采用后向 (backward)減式方法。 缺點：該方法尚不完善和不穩(wěn)定， 所獲得的結(jié)果需 Northern印跡法證實， 并且插入子的片段較短，缺少 5’或 3’端， 對低豐度 mRNA效果不佳。 目前，多主張將減式方法和均一化方法
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