cdna測(cè)序和表達(dá)譜研究(存儲(chǔ)版)
【正文】 果收集各類組織和細(xì)胞的基因表達(dá)譜，將每一個(gè)表達(dá)的基因標(biāo)記到其表達(dá)的組織，就能組成一張人體基因圖； ③ 對(duì)基因表達(dá)譜作兩兩或多重比較，就能篩選出細(xì)胞特異性或發(fā)育階段特異性的基因。 兩個(gè)缺陷： A. 插入片段全長(zhǎng)常常缺乏 5’端序列，尤其是 mRNA長(zhǎng)度2kb者。 編制表達(dá)譜的 cDNA文庫(kù)應(yīng)是 “非偏性 cDNA文庫(kù)”，至少滿足下列基本條件： ①該文庫(kù)來自處于某一特定生理或病理狀態(tài)的細(xì)胞或組織(如腦、肝臟、中性粒細(xì)胞、 CD34+干 /祖細(xì)胞等 )。 重疊群中序列的拷貝數(shù) (或稱表達(dá)頻率 )代表該基因的表達(dá)豐度。上述標(biāo)準(zhǔn)純粹是經(jīng)驗(yàn)性的，不同學(xué)者有不同分類標(biāo)準(zhǔn)。 分類后，與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因和細(xì)胞骨架蛋白基因的表達(dá)最為活躍，其豐度分別占 22％和 20％，表明角質(zhì)化細(xì)胞正處于快速增殖階段。 其中 6個(gè)是已知基因：角蛋白 載脂蛋白 J、 熱休克蛋白 2 肌鈣蛋白 I快速抽搐異分體 、 心臟縫隙連接蛋白和醛脫氫酶 3；其余 6種是全新基因。 Yokoyama等 (1996) 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 (CHPl34)基因表達(dá)譜與 HepG結(jié)腸黏膜細(xì)胞等 6種基因表達(dá)譜比較，并結(jié)合 RNA印跡，鑒定了 2個(gè)全新的候選 CHPl34特異性基因。 任務(wù)艱巨：人體由 6 1013個(gè)細(xì)胞組成，人體基本組織或細(xì)胞類型大約只有 200種。與此同時(shí)，對(duì)發(fā)育、分化、進(jìn)化和衰老等基本生命現(xiàn)象，以及嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)也會(huì)得到深入。 如， Okubo等 (1994)已獲得了人結(jié)腸黏膜的基因表達(dá)譜，若再能獲得十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸的基因表達(dá)譜，必然能在分子水平上豐富我們對(duì)腸道不同區(qū)域生理功能差異的認(rèn)識(shí)。 (四 )基因表達(dá)譜比較研究的應(yīng)用 篩選和鑒定候選的細(xì)胞或組織特異性表達(dá)基因。 Nishida等 (1996) 構(gòu)建了源自角膜上皮細(xì)胞的 3’端方向 cDNA文庫(kù)，測(cè)序獲得 1,062個(gè) GS序列，按上法將它們編制成基因表達(dá)譜。如細(xì)胞漿蛋白還可細(xì)分為與能量代謝相關(guān)的蛋白、溶酶體酶類、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等。 根據(jù) EST或 GS序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列的同源性程度大小，分為以下幾類 ： ① 已知基因：重疊區(qū) 70bp， 同源程度 95％； ②與同物種部分同源基因：重疊區(qū) 70bp， 同源程度 60％ 95％； ③與不同物種部分同源基因：重疊區(qū) 70bp， 同源程度 60％； ④全新基因：除前三者外的所有基因。 2. 借助程序或軟件對(duì)序列作相互間的重復(fù)比對(duì)，構(gòu)建重疊群。 該段序列位于 polyA位點(diǎn)上游的非編碼區(qū) (3’ UTR)， 不如編碼區(qū)保守，更易區(qū)分不同基因和同一基因家族的不同成員，因此對(duì)于鑒定基因更有特異性。 ① 為綜覽人體全部基因種類而設(shè)計(jì)，以發(fā)現(xiàn)新基因?yàn)槟康摹? 即： 特定狀態(tài)； 分析所有的基因表達(dá)； 得到基因表達(dá)種類和豐度表。 與核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較 : ① 可以提示所獲順序是否新基因，是否一個(gè)基因家族的新成員，是否在生物進(jìn)化過程中保守。此時(shí)，在保證順序正確的同時(shí)，對(duì)翻譯的順序進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域和比較基因組分析，可幫助確定是否含有 ORF。 ③ 測(cè)序從 5’和 3’同時(shí)進(jìn)行。 大量獲得全長(zhǎng) cDNA的策略 構(gòu)建富含全長(zhǎng) cDNA的文庫(kù)和電腦克隆 ① 構(gòu)建富含全長(zhǎng) cDNA的文庫(kù)。 UniGene： ① 多個(gè) EST組成，能相互重疊，可以形成較長(zhǎng)的重疊序列。 由數(shù)據(jù)庫(kù)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分組成，在基因組計(jì)劃中發(fā)揮了不可取代的作用。 優(yōu)點(diǎn) : 常規(guī) cDNA文庫(kù)所獲克隆較少含有 5’端非編碼區(qū)，而多在 ORF內(nèi)， 5‘端測(cè)序的結(jié)果較容易判斷是否新基因。 ② PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序： 已為多數(shù)基因中心所接受， PCR模板： cDNA文庫(kù)所轉(zhuǎn)化的菌落、細(xì)菌裂解液或抽提的質(zhì)粒； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：經(jīng)適當(dāng)處理如純化或酶處理等，即可進(jìn)行測(cè)序。 (4)減式 cDNA文庫(kù) 根據(jù)研究目的，可采用不同的減式方法。 ① 表達(dá)譜分析：常規(guī)的 cDNA文庫(kù)，如： oligodT引物定向克隆 cDNA文庫(kù)或隨機(jī)引物法構(gòu)建 cDNA文庫(kù)； ② 獲得更多的全長(zhǎng) cDNA： 構(gòu)建全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)，如： smartPCR和 oligoPCR； ③ 增加 EST種類：均一化 (normalized)cDNA文庫(kù)； ④ 克隆不同狀態(tài) (藥物處理的不同時(shí)相、不同病理及疾病的不同發(fā)展階段等 )的相關(guān)基因：減式 cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法。 全長(zhǎng) cDNA 是功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)， 有功能意義的全長(zhǎng) cDNA可以申請(qǐng)專利， 因此，除研究部門外，大藥廠和生物技術(shù)公司也投入重金進(jìn)行研究和搶占專利。 公共數(shù)據(jù)庫(kù) GenBank( dbEST) UniGene： 為了弄清 EST間的關(guān)系，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (NCBl)根據(jù) EST相似性比較進(jìn)行聚類分析，形成數(shù)據(jù)庫(kù) UniGene ( UniGene) 當(dāng)前 cDNA測(cè)序的趨勢(shì) : 由對(duì) EST的隨機(jī)測(cè)序， 轉(zhuǎn)向全長(zhǎng) cDNA的克隆和測(cè)序。 主要步驟： 1)cDNA文庫(kù)構(gòu)建 2)DNA測(cè)序 3)信息處理和管理 4)生物信息學(xué)分析 1. cDNA文庫(kù)構(gòu)建 研究目的不同 —采用不同的 cDNA文庫(kù)構(gòu)建
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