【正文】 專題1 基因工程 DNA重組技術的基本工具一、 教學目標簡述DNA重組技術所需三種基本工具的作用。認同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術創(chuàng)新。二、 教學重點和難點DNA重組技術所需的三種基本工具的作用?；蚬こ梯d體需要具備的條件。三、教學方法講授法，對話法四、教學課時2五、教學過程基因工程的概念：“基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品?！币?、限制性核酸內切酶——“分子手術刀”⑴來源⑵作用〖問題〗？〖生思考討論回答，師提示〗3,5磷酸二酯鍵是核酸中核苷酸的連接方式，組成了核酸的一級結構。在核酸中一個核苷酸核糖上第3位的羥基與下一個核苷酸核糖上第5位的磷酸羥基脫水縮合成酯鍵，該酯鍵稱3,5磷酸二酯鍵。若干個核苷酸間以3′,5′磷酸二酯鍵（如下圖）連接成的多核苷酸鏈為核酸。在鏈的一端的一個核苷酸，其核糖上第5位連接的磷酸只有一個酯鍵，稱此核苷酸為DNA鏈的5′磷酸末端或5′端。另一端核苷酸上第3位的羥基是自由的，所以此核苷酸稱為3′羥基末端或3′端。鏈內的核苷酸第5位上的磷酸已形成二酯鍵，第3位上的羥基也已參與二酯鍵的形成，故稱核苷酸殘基。圖 DNA上的磷酸二酯鍵〖尋根問底1〗，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？〖生思考討論回答，師提示〗：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的?！紗栴}〗，想一想，為什么細菌中限制酶不剪切細菌本身的DNA？〖生思考討論回答，師提示〗迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識別和切斷DNA上特定的堿基序列。細菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因為微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，對于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。⑶結果①黏性末端②平末端〖問題〗？〖生思考討論回答，師提示〗限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線（如右圖），中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的?！妓伎寂c探究〗？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：(1) …CTGCA (2) …AC (3) GC… （4） …G (5)G… (6) …GC …G …TG CG… …CTTAA ACGTC… …CG(7) GT…(8)AATTC…CA… G…你是否能用DNA連接酶將它們連接起來？〖生思考討論回答，師提示〗答：任何一種限制酶都只識別和切斷特定的核苷酸序列，這是由限制酶的性質所決定的。2和7能連接形成…ACGT… 4和8能連接形成…GAATTC… …TGCA…； …CTTAAG…；3和6能連接形成…GCGC… 1和5能連接形成…CTGCAG… …CGCG…； …GACGTC…。二、DNA連接酶——“分子縫合針”㈠分類連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為Ecoli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。㈡作用這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA?！紗栴}〗？〖生思考討論回答，師提示〗DNA連接酶是將一段DNA片段3′端的羥基與另一DNA片段5′端磷酸基團上的羥基連接起來形成酯鍵，而不是連接互補堿基之間的氫鍵?！紗栴}〗7. DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？答：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為Ecoli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質構成的酶，但組成和性質各不相同。〖網(wǎng)上查詢〗？〖生思考討論回答，師提示〗：迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。三、基因進入受體細胞的載體——“分子運載車”〖旁欄思考題〗想一想，具備什么條件才能充當“分子運輸車”？〖生思考討論回答，師提示〗：能自我復制、有一個或多個切割位點、有標記基因位點及對受體細胞無害等〖問題〗？為什么？〖生思考討論回答，師提示〗：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒（plasmid），即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1） 載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。（2） 載體DNA必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。（3） 載體DNA必需帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。（4） 載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。（5） 載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作?！寄M制作討論題〗1. 你模擬插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？〖生思考討論回答，師提示〗：不能。因為一般基因有上千個堿基對。2. 如果你操作失誤，堿基不能配對?？赡苁鞘裁丛蛟斐傻?？〖生思考討論回答，師提示〗可能是剪切位點或連接位點選得不對（也可能是其他原因）。 基因工程的基本操作程序一、 教學目標簡述基因工程原理及基本操作程序。嘗試設計某一轉基因生物的研制過程。二、 教學重點和難點基因工程基本操作程序的四個步驟。（1）從基因文庫中獲取目的基因。（2）利用PCR技術擴增目的基因。三、教學方法講授法、對話法四、教學課時2五、教學過程〖對話〗﹙先解決為什么要分四個步驟的問題，然后解決每一步驟的技術方法問題。﹚1．為什么要有“目的基因的獲取”這一步？〖學生思考討論回答，師提示〗引導學生看本專題題圖中基因工程的概念：“基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更