【正文】 . . . . PCR技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的研究進(jìn)展王亞純 09120103 摘要：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，通過變性、退火和延伸的循環(huán)來完成核酸分子的大量擴(kuò)增．定量PCR技術(shù)是克服了原有的PCR技術(shù)存在的不足，能準(zhǔn)確敏感地測定模板濃度及檢測基因變異等，快速PCR技術(shù)快速PCR在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性和保真度的前提下，在更短時間內(nèi)完成對核酸分子的擴(kuò)增．mRNA 差異顯示PCR技術(shù)是在基因轉(zhuǎn)錄水平上研究差異表達(dá)和性狀差異的有效方法之一．近年來已經(jīng)開展了許多這三方面的研究工作，本文就定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)作一綜述，以便更好地理解及應(yīng)用這項技術(shù)。　　關(guān)鍵字：定量PCR；熒光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差異顯示PCR　　0 前言　　聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)由于PCR簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制[1]。鑒于此，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量便成為迫切的需要。幾經(jīng)探索，先后出現(xiàn)了多種定量PCR (quantitative PCR，QPCR)方法，其中結(jié)果較為可靠的是競爭性PCR和熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)QPCR)?！　‰S著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測的不斷發(fā)展，人們越來越希望在保證PCR反應(yīng)特異性、靈敏性、保真度的同時，能夠盡量縮短反應(yīng)的時間，即實現(xiàn)快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)?？焖貾CR技術(shù)不僅可使樣品在有限的時間內(nèi)可以盡快得到擴(kuò)增，而且可以顯著增加可檢測的樣品數(shù)量，顯然，在大批量樣本檢測和傳染病快速診斷等方面將會有重要的應(yīng)用前景。例如，快速PCR在臨床檢測中可大大加快疾病的診斷效率；在生物恐怖襲擊時能有效幫助快速鑒定可疑物中有害生物的存在與否；同時，由于PCR已經(jīng)滲入到現(xiàn)代生物學(xué)研究的各個方面，快速PCR的實現(xiàn)必然可以使許多科學(xué)研究工作的進(jìn)展顯著加快，最終影響到整個生物學(xué)發(fā)展的速度。近年來，快速PCR技術(shù)得到了可喜的進(jìn)展。從聚合酶的改進(jìn)、添加劑的開發(fā)以及熱循環(huán)儀的革新創(chuàng)造三個不同途徑上分別進(jìn)行的研發(fā)表明?！　∩锏男誀詈蜕飳Ω鞣N生物、理化及致病因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都是基因在時間上或空間上選擇性表達(dá)，即基因的差異表達(dá)的結(jié)果，因而，獲取差異表達(dá)的基因信息，將有助于了解生物的生理變化和病理改變的分子機(jī)制[2]。研究基因差異表達(dá)主要技術(shù)有：消減文庫篩選、差異雜交、代表性差異分析、基因表達(dá)序列分析、電子消減技術(shù)[3]和mRNA差異顯示PCR技術(shù)等(mRNA Differential Display PCR，簡稱DDPCR[4] )。迄今為止，上面的幾種方法已成功地用于基因差異表達(dá)的研究。尤其是mRNA差異顯示PCR技術(shù)，雖然發(fā)明只有短短十幾年，已經(jīng)取得了令人矚目的科研成果，原因是它具備需要總RNA 的量極少，不需要純化的mRNA，操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點[58]，故已被許多生命科學(xué)實驗室作為一種重要工具，應(yīng)用于體內(nèi)和體外差異表達(dá)基因的篩選，研究基因功能[9]?，F(xiàn)將定量PCR技術(shù)、快速PCR技術(shù)、mRNA差異顯示PCR技術(shù)研究情況作一綜述作簡要綜述。1 定量PCR技術(shù)　　定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴(yán)格意義的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴(kuò)增效率）達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為零)。廣義概念下的定量PCR技術(shù)可以分為五種類型： 　?。?）外參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在兩個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果，沒有監(jiān)測擴(kuò)增效率，定量不準(zhǔn)。 　?。?）內(nèi)參法+終產(chǎn)物分析，是指樣本與陽性參照在一個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測，排除假陰結(jié)果，但是定量不準(zhǔn)。 　?。?）外標(biāo)法+過程監(jiān)測，這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，但是無法排除假陰結(jié)果?！　。?）內(nèi)參法+過程監(jiān)測，由于樣本與陽性參照在一個容器內(nèi)反應(yīng)，用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物，存在競爭性抑制，起始模板量濃度高的反應(yīng)會抑制起始模板量濃度低的反應(yīng)，所以定量不準(zhǔn)。 　　（5）外標(biāo)法+過程監(jiān)測+內(nèi)對照，這種類型監(jiān)測擴(kuò)增效率，陽性樣本定量準(zhǔn)，同時排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。 競爭性PCR技術(shù)　　定量PCR技術(shù)是對傳統(tǒng)PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和補(bǔ)充，在定量過程中需借助各種形式的參照物。參照物是一種已知含量的標(biāo)準(zhǔn)模板，按其是否與待測樣品在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增而分為內(nèi)參照和外參照。鑒于PCR擴(kuò)增過程中管與管之間的擴(kuò)增效率存在差異，理想的定量PCR應(yīng)該使用內(nèi)參照。競爭性PCR即是采用內(nèi)參照的一種定量PCR方法，通過消除管間及樣品間的變異，從而達(dá)到較為精確的基因定量[10]。該方法是將待測基因與已知濃度的內(nèi)參照模板在同一反應(yīng)管中共同擴(kuò)增，由于二者具有相同引物的結(jié)合位點并采用同一引物進(jìn)行擴(kuò)增，因此二者競爭引物、脫氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致當(dāng)一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物就會逐漸減少。兩模板的擴(kuò)增產(chǎn)物量可分別用以下公式表示：Y待測= X待測(1+E)n；Y內(nèi)參照= X內(nèi)參照(1+E)n，其中X待測為起始拷貝量；Y待測為擴(kuò)增產(chǎn)物量。由于在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增，兩模板的循環(huán)次數(shù)n保持一致，如果使兩者間的擴(kuò)增效率E也相同，就存在如下關(guān)系：Y待測/Y內(nèi)參照= X待測/X內(nèi)參照。當(dāng)兩模板的產(chǎn)物量相同時，則兩模板的反應(yīng)起始拷貝數(shù)相等，由此可對待測模板進(jìn)行精確定量。具體檢測方法是將已知濃度的內(nèi)參照模板倍比稀釋后分別與恒定量的待測基因一起擴(kuò)增，以參照模板的起始拷貝數(shù)為橫軸，以兩模板擴(kuò)增產(chǎn)物量的比率為縱軸，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為1的點所對應(yīng)的參照模板的起始拷貝數(shù)即為待測基因的拷貝數(shù)。由上述定量原理可知，保持兩模板擴(kuò)增效率E的一致性是定量的關(guān)鍵，為此要求參照模板應(yīng)與待測基因具有相似的大小及序列，相同的引物結(jié)合位點。此外，參照模板還應(yīng)在擴(kuò)增后易于分離檢測。因此，對于競爭性PCR的研究重點主要集中在建立高效、穩(wěn)定、可靠的模板方面，現(xiàn)已取得了較滿意的結(jié)果[1113]?！?． 2 熒光定量PCR技術(shù)　　熒光定量PCR（RQPCR技術(shù)）是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。Ct值( cycle threshold，Ct )，即PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，它與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 Taqman技術(shù)　　Taqman 技術(shù)由美國PE公司開發(fā)，現(xiàn)已廣