細(xì)胞生物學(xué)研究方法(3)(已修改)
2025-01-28 21:04 本頁面
【正文】 第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 METHODS AND TECHNIQUES 本章內(nèi)容提要 ? 第一節(jié) 顯微技術(shù) ? 一、光學(xué)顯微鏡 ? 二、電子顯微鏡 ? 三、顯微操作技術(shù) ? 第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) ? 第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù) ? 第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交 第一節(jié) 顯微技術(shù) ? 光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 ? 電子顯微鏡：以電子束為光源。 — 、光學(xué)顯微鏡 ? 1. 構(gòu)成： ? ①照明系統(tǒng) ? ②光學(xué)放大系統(tǒng) ? ③機械裝置 ? 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。 （一）普通光學(xué)顯微鏡 ? 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力 。 ? D=*A – 其中 λ為入射光線波長； A為鏡口率 ＝ sinα/2， N 介質(zhì)折射率； α=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） ? 思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？ 表一、幾種介質(zhì)的折射率 介質(zhì) 空氣 水 香柏油 α 溴萘 折射率 1 ? 顯微鏡的幾個光學(xué)特點： – 制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為 ~，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 – sin α /2的最大值必然小于 1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為 ~；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近 。 – 普通光線的波長為 400~700nm，分辨力數(shù)值不會小于，人眼的分辨力為 ，因此顯微鏡的最大設(shè)計倍數(shù)為 1000X。 （二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope P53 ? 特點：光源為紫外線 ， 波長較短 ， 分辨力高于普通顯微鏡； ? 有兩個特殊的濾光片； ? 照明方式通常為落射式 。 Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green ? 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。 （三）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM P53 ? 用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。 ? 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 ? 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的 3倍。 ? 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。 laser confocal scanning microscope, LCSM LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) （四）暗視野顯微鏡 dark field microscope ? 聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 ? 可觀察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高 50倍。 ? 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差 ， 從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度 ， 使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見 。 在構(gòu)造上 ， 相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處： 1. 環(huán)形光闌 （ annular diaphragm） ：位于光源與聚光器之間 。 2. 相位板 （ annular phaseplate） ：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板 ， 可將直射光或衍射光的相位推遲 1/4λ。 （五）相差顯微鏡 P51 原理 用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本 （六）偏光顯微鏡 polarizing microscope ? 用于檢測具有雙折射性的物質(zhì) ， 如纖維絲 、 紡錘體 、 膠原 、 染色體
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