【正文】 項(xiàng)目名稱： 調(diào)控內(nèi)胚層組織器官發(fā)育的分子機(jī)制研究 首席科學(xué)家： 羅凌飛 西南大學(xué) 起止年限： 至 依托部門： 教育部 重慶市科委 1 一、研究內(nèi)容 在本項(xiàng)目擬開展的研究工作中，我們將應(yīng)用斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠等模式動物和胚胎干細(xì)胞研究體系，以肝臟和胰腺這兩個(gè)重要的內(nèi)胚層器官為主要研究對象，輔以腸道的研究，沿著從內(nèi)胚層細(xì)胞到內(nèi)胚層器官前體細(xì)胞的命運(yùn)預(yù)定、到前體細(xì)胞的分化和成熟功能細(xì)胞的形成、到器官的形態(tài)建成、功能發(fā)揮、和受損再生的動態(tài)連續(xù)過程，全面深入地研究在內(nèi)胚層組 織器官特別是肝臟和胰腺的發(fā)育和再生過程中發(fā)揮重要功能的因子、信號途徑和表觀遺傳穩(wěn)定性的作用機(jī)制，并闡明其中可能存在的時(shí)間、空間網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)。按照本項(xiàng)目擬設(shè)置的三個(gè)課題，具有研究內(nèi)容如下： 課題一：調(diào)控肝臟 和 腸道發(fā)育的分子機(jī)理研究 1. 斑馬魚體節(jié)形成早期預(yù)定的肝臟和腸道前體細(xì)胞在內(nèi)胚層中的細(xì)胞譜系定位。 1）可 用于 精確 定位和 分選預(yù)定的肝臟 、腸道 前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的建立； 2） 4－ 6 體節(jié)時(shí)期預(yù)定的肝臟和腸道前體細(xì)胞在內(nèi)胚層中的細(xì)胞譜系定位。 2. 在 斑馬魚 預(yù)定的肝臟 或腸道 前體細(xì)胞中 特異和差 異表達(dá)基因 的 篩選及其功能機(jī)制研究。 1） 4－ 6 體節(jié)時(shí)期 斑馬魚預(yù)定的肝臟 、腸道 前體細(xì)胞 分選， 兩者 之間及其分別與原腸中期內(nèi)胚層細(xì)胞 差異表達(dá)基因的芯片篩選 ； 2）差異表達(dá)基因發(fā)揮功能的分子機(jī)理 研究。 3. 肝細(xì)胞命運(yùn)決定后調(diào)控 肝臟發(fā)育 基因 的 篩選與功能研究。 1）肝臟 發(fā)育 不同時(shí)期的差異表達(dá)基因的芯片篩選； 2） 差異表達(dá)基因的功能和作用機(jī)理研究。 4. 利用胚胎干細(xì)胞體系研究肝前體及肝細(xì)胞體外分化的分子機(jī)理。 1）胚胎干細(xì)胞向肝臟前體細(xì)胞分化過程中命運(yùn)決定的分子機(jī)理； 2）胚胎干細(xì)胞來源的肝臟前體細(xì)胞的基因表達(dá)特性分析，影響其定向分化的關(guān)鍵基因的尋找及作用機(jī)理研究； 3）胚胎 干細(xì)胞來源的肝臟前體細(xì)胞的體外分化能力及分子機(jī)理研究。 2 5. 組蛋白 H3的 N端 三甲基化表觀遺傳調(diào)控機(jī)制 在由胚胎干細(xì)胞到 肝細(xì)胞分化過程 中的功能。 1）肝干細(xì)胞的形成與分化中組蛋白 H3 N 端 三甲基化與染色質(zhì)形成的關(guān)系； 2）肝細(xì)胞 特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶的克??； 3）H3 N 端三甲基化在從胚胎干細(xì)胞到肝細(xì)胞分化過程中的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能的系統(tǒng)研究； 4）肝細(xì)胞 特異 性 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶在肝細(xì)胞形成與分化中的作用與分子機(jī) 理。 6. 表觀遺傳在 斑馬魚 內(nèi)胚層器官發(fā)育的不同階段的穩(wěn)定性及其功能的系統(tǒng)研究。 1）在 斑馬魚 內(nèi)胚層 器官發(fā)育的不同階段 對 H3K4Me H3K27MeH3K9/18Ac、 H4K12Ac 的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能 的系統(tǒng) 化 研究； 2）選取 具有代表性的 表觀遺傳 位點(diǎn)，研究染色質(zhì) 上相應(yīng)位點(diǎn) 附近基因 在調(diào)控 內(nèi)胚層器官 發(fā)育 中的 功能 及分子機(jī)理 。 7. 具有 肝臟發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機(jī)制 研究。 1） 具有 肝臟 發(fā)育缺陷突變體的表現(xiàn)型 研究； 2） 導(dǎo)致 肝臟 發(fā)育缺陷的致變基因 克隆及其調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究 。 8. NEMO/IKK?的 K63 多泛素化在調(diào)控肝臟發(fā)育中的功能與分子機(jī)理。 1）NEMO/IKK?及其多泛素化在調(diào)控斑馬魚肝臟發(fā) 育中的功能； 2） NEMO/IKK?多泛素化酶的確定及其在肝臟發(fā)育中的功能 。 9. Wnt 信號途徑及其 上游 調(diào)控因子 KLP 在斑馬魚肝臟發(fā)育中的功能機(jī)制。 1）Wnt 信號途徑調(diào)控 肝臟發(fā)育的分子機(jī)理； 2） KLP 調(diào)控 肝 臟發(fā)育 的分子機(jī)理 。 課題二：調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī)理研究 1. 在 斑馬魚 預(yù)定的 胰內(nèi)外分泌 前體細(xì)胞中 差 異表達(dá)基因 的 篩選及其功能機(jī)制研究。 1）斑馬魚 原腸中后期 內(nèi)胚層細(xì)胞 、 4－ 6 體節(jié)時(shí)期 預(yù)定的 內(nèi)、外分泌前體細(xì)胞 及 非預(yù)定 的胰腺 前體細(xì)胞的分選， 四 者差異表達(dá)基因的芯片篩選 ；2）差異表達(dá)基因的表達(dá)模式、功能和作用機(jī)制研究。 2. 非洲爪 蟾 預(yù)定的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞 特異性調(diào)控因子的篩選和功能機(jī)制研究。 1）非洲爪蟾囊胚晚期 /原腸早期預(yù)定的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞譜系分析定位； 3 2） 基因芯片比較正常的預(yù)定胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞與 BMS453 處理過的內(nèi)胚層細(xì)胞、 RA 處理過的內(nèi)胚層細(xì)胞、高表達(dá)了 Hex 的內(nèi)胚層細(xì)胞、高表達(dá)了 VegT和 βcatenin 的爪蟾胚胎多能性前體細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜以篩選出決定預(yù)定胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的特異性內(nèi)在調(diào)控因子； 3）對篩選所得重要調(diào)控因子發(fā)揮功能的分子機(jī)理研究。 3. 非洲爪蟾胰腺特異性表達(dá)的新基因的篩選及功能機(jī)制研究。 1）利用大規(guī)模整體原位雜交從 非洲爪蟾胚胎及成體的胰腺 cDNA 文庫中篩選胰腺特異性表達(dá)的新基因； 2）新基因調(diào)控胰腺發(fā)育的功能及分子機(jī)理研究。 4. Hex 特異性地誘導(dǎo)腹側(cè)胰腺前體細(xì)胞增多的分子機(jī)理研究。 1） Hex 在原腸胚期過量表達(dá)誘導(dǎo)巨大腹側(cè)胰腺的細(xì)胞機(jī)制研究； 2） Hex 的相互作用因子、在染色質(zhì)上附著位點(diǎn)、下游調(diào)控基因的篩選及其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī)理研究。 5. 非洲爪蟾胚胎胰腺和肝臟的體外重建。 1）在經(jīng)過早期紫外線照射形成的爪蟾 belly piece 中選擇性地恢復(fù)胰腺和肝臟形成的研究。 2）在體外誘導(dǎo)爪蟾胚胎多能性前體細(xì)胞形成胰腺及真正成熟的胰島 β細(xì)胞的研究。 6. 利用胚胎干細(xì)胞體系研究胰腺細(xì)胞體外分化的分子機(jī)理。 1）分別建立 pdx1和 ngn3 啟動子驅(qū)動的報(bào)告體系； 2）研究 RA, BMP, FGF 等信號途徑調(diào)控pdx1 表達(dá)的分子機(jī)理； 3）胰腺前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析，胰腺前體細(xì)胞向內(nèi)分泌細(xì)胞分化過程中的信號調(diào)控機(jī)制研究； 4）胰內(nèi)分泌前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析， Ngn3 下游調(diào)控基因的表達(dá)譜分析 。 7. 具有胰腺 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機(jī)制 研究。 1） 具有胰腺發(fā)育缺陷突變體的表現(xiàn)型 研究； 2） 導(dǎo)致胰腺發(fā)育缺陷的致變基因 克隆及其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī)理研究 。 8. 分離小鼠內(nèi)胚層組織的成體干細(xì)胞，確定干細(xì)胞的分化途徑以及分化的子代細(xì)胞 譜 。 1） 利用三維培養(yǎng)體系，從小鼠胚胎和新生小鼠體內(nèi)分離和富 集 內(nèi)胚層組織的干細(xì)胞 /前體細(xì)胞，確定其表面標(biāo)記 ； 2） 分析成體小鼠內(nèi)的干細(xì)胞 /前體細(xì)胞組分 ； 3） 分析 內(nèi)胚層組織 干細(xì)胞 /前體細(xì)胞的 特異 基因表達(dá)模式，確定干細(xì)胞 /前 體 細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá) ； 4） 建立體外干細(xì)胞 /前體細(xì)胞分化體 4 系 ， 確定內(nèi)胚層 組織的 細(xì)胞分化譜 ； 5） 建立體內(nèi)細(xì)胞分化測定體系，確定體內(nèi)分化 細(xì)胞 譜，比較體內(nèi)外分化譜的異同，明確 內(nèi)胚層組織的 細(xì)胞分化測定手段。 9. 在小鼠胚胎發(fā)育過程中，確定 小鼠內(nèi)胚層組織的干細(xì)胞 /祖細(xì)胞的形成 、 分化的子代細(xì)胞 譜與分化 途徑，探索內(nèi)胚層組織的構(gòu)筑。 1）標(biāo)記內(nèi)胚層特異表達(dá)基因，在成體 內(nèi)胚層組織 內(nèi)確定基因表達(dá)譜的特異性 ； 2） 分離小鼠器官形成期的胚胎，確定特異基因在小鼠胚胎中的組織特異性 ； 3）篩選內(nèi)胚層分化過程中的 特異表達(dá)的基因 ； 4） 分離 單 細(xì)胞到器官形成期的小鼠胚胎，對 胚胎內(nèi)胚層 細(xì)胞進(jìn)行譜系定位 ，為系統(tǒng)分析小鼠內(nèi)胚胎發(fā)育提供基礎(chǔ) 。 10. 建立內(nèi)胚層組織特異基因條件 敲除 小鼠， 標(biāo)記內(nèi)胚層組織起源細(xì)胞， 分析內(nèi)胚層組織的形成與構(gòu)筑的過程，探討內(nèi)胚層組織形成的分子機(jī)制。 1）確定內(nèi)胚層發(fā) 育的特異基因 ； 2）構(gòu)建條件性基因打靶的 ES 細(xì)胞 ， 體外分析細(xì)胞的分化能力 ； 3）構(gòu)建條件基因打靶小鼠 ； 4）分析內(nèi)胚層分化發(fā)育的分子基礎(chǔ)與分子機(jī)制。 課題三： 正向遺傳突變篩選具有 內(nèi)胚層器官發(fā)育或再生缺陷的突變體及致變基因的功能機(jī)制研究 1. 斑馬魚肝臟和胰島 β 細(xì)胞再生模型的建立及 ENU 正向遺傳突變篩選研究在肝臟或胰腺發(fā)育、肝臟或 β細(xì)胞再生過程中發(fā)揮重要功能的基因及其 作用機(jī)制 。 1）斑馬魚肝臟和胰島 β細(xì)胞再生模型的建立及再生的細(xì)胞過程研究； 2）ENU 化學(xué)誘變篩選具有肝臟或胰腺發(fā)育缺陷、肝臟或 β 細(xì)胞再生缺陷的突變體及其表現(xiàn) 型研究； 3）致變基因的克隆和功能機(jī)制研究。 2. 斑馬魚胰外分泌腺再生模型的建立及 ENU 正向遺傳突變篩選研究在胰外分泌腺再生過程中發(fā)揮重要功能的基因及其 作用機(jī)制 。 1）斑馬魚胰外分泌腺再生模型的建立及再生的細(xì)胞過程研究； 2） ENU 化學(xué)誘變篩選具有胰外分泌腺再生缺陷的突變體及其表現(xiàn)型研究； 3）致變基因的克隆和功能機(jī)制研究。 5 3. 通過增強(qiáng)子誘捕獲得的胰腺 GFP 標(biāo)記轉(zhuǎn)基因魚的基因定位、鑒定及功能研究 。 1）對 獲得的胰腺 GFP 標(biāo)記轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行基因定位并鑒定候選基因； 2）新 基因 的 功能 及分子機(jī)理 研究 。 4. 利用轉(zhuǎn)座子 介導(dǎo)的插入突變 篩選具 有肝臟 、胰腺或腸道 發(fā)育缺陷的突變體及致變基因的功能機(jī)制研究。 1） 攜帶轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的建立； 2）具有肝臟 、胰腺或腸道 發(fā)育缺陷的突變體篩選； 3）致變基因的克隆和功能機(jī)制研究。 6 二、預(yù)期目標(biāo) （一）總體目標(biāo) 針對內(nèi)胚層組織器官的發(fā)育與再生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，依托并聯(lián)合運(yùn)用本項(xiàng)目申請組已建立的斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠和胚胎干細(xì)胞研究平臺，揭示調(diào)控從內(nèi)胚層細(xì)胞到肝臟和胰腺等主要內(nèi)胚層器官前體細(xì)胞的命運(yùn)預(yù)定和分化、到成熟功能細(xì)胞的形成、到器官的形態(tài)建成、功能發(fā)揮、和受損再生的這一動態(tài)連續(xù)發(fā)育過程中各個(gè)階段的分 子機(jī)理。整合各個(gè)課題的研究成果，在分子水平上 描繪出調(diào)控內(nèi)胚層 組織 器官發(fā)育的整體藍(lán)圖 ， 為滿足國家對重大疾病防治的迫切需求服務(wù) 。 通過本項(xiàng)目的實(shí)施，在發(fā)現(xiàn)預(yù)定的肝臟和胰腺前體細(xì)胞的分子標(biāo)記和重要命運(yùn)決定因子、揭示內(nèi)胚層組織器官發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制、闡明調(diào)控肝臟和胰腺形態(tài)建成及受損再生的分子機(jī)理等國際研究前沿領(lǐng)域有所突破，為使我國的內(nèi)胚層組織器官發(fā)育研究進(jìn)入國際先進(jìn)行列打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。 （二）五年預(yù)期目標(biāo) 1. 建立并完善我國利用模式動物和 胚胎 干細(xì)胞研究 以 肝臟 和 胰腺 為代表的 內(nèi)胚層 組織 器官發(fā)育 和再生 的研究體系。 2. 發(fā)現(xiàn)并鑒定預(yù)定的肝臟或胰腺前體細(xì)胞的分子標(biāo)記和關(guān)鍵命運(yùn)決定因子，闡明其發(fā)揮功能的分子機(jī)理，填補(bǔ)國際上缺乏預(yù)定的肝臟和胰腺前體細(xì)胞的早期分子標(biāo)記這一研究空白。 3. 篩選 并 鑒定 5－ 10 個(gè)在內(nèi)胚層 組織 器官發(fā)育過程中及 2－ 3 個(gè)在肝臟或胰腺的再生過程中發(fā)揮重要功能的 新 因子， 闡明其發(fā)揮功能的分子機(jī)理。 4. 構(gòu)建 2－ 4 個(gè)特異基因 條件 打靶小鼠，初步分析這些基因在內(nèi)胚層 組織器官發(fā)育中的作用。 5. 同時(shí)以胚胎干細(xì)胞和斑馬魚為研究體系，闡明表觀遺傳機(jī)制特別是組蛋白修飾機(jī)制在調(diào)控內(nèi)胚層組織器官發(fā)育中的功能及機(jī)制。 6. 整合已有的知識及本項(xiàng)目各個(gè)課 題的研究成果，深入 揭示多種 因 子 、 信號途 7 徑 、表觀遺傳機(jī)制等聯(lián)合 調(diào)控內(nèi)胚層 組織 器官的前體細(xì)胞命運(yùn)決定、形態(tài)建成、功能發(fā)揮和受損再生 這一連續(xù) 過程 的時(shí)空分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 。 7. 聯(lián)合我國的斑馬魚研究資源庫，本項(xiàng)目實(shí)施過程中建立和獲得的所有轉(zhuǎn)基因和突變種系都將通過我國的斑馬魚研究資源庫成為國內(nèi)科研工作者的共享資源。 8. 發(fā)表 40－ 50 篇 SCI 學(xué)術(shù)論文，其中影響因子大于 5 的 15－ 20 篇， 影響因子大于 10 的 5－ 10 篇 ；申請專利 4－ 7 個(gè) 。 9. 通過項(xiàng)目培養(yǎng)青年科技骨干人才， 培養(yǎng)高水平博士后 5－ 10 人、博士研究生50－ 70 人 ；建立并逐漸壯大 一 支 活躍 在 內(nèi)胚層 組織 器官發(fā)育研究領(lǐng)域的創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)和中青年學(xué)術(shù)帶頭人隊(duì)伍 ，并至少 有兩位青年科學(xué)家在項(xiàng)目實(shí)施過程中獲得國家杰出青年基金資助 。 8 三、研究方案 （一）技術(shù)路線 課題一：調(diào)控肝臟 和 腸道發(fā)育的分子機(jī)理研究 1. 斑馬魚體節(jié)形成早期預(yù)定的肝臟和腸道前體細(xì)胞在內(nèi)胚層中的細(xì)胞譜系定位。 1） 可 用于 精確 定位和 分選預(yù)定的肝臟 、腸道 前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的建立 。建立 sox17:Kaede 和 sox17:Dendra 轉(zhuǎn)基因魚，這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系是在斑馬魚中進(jìn)行內(nèi)胚層細(xì)胞 精確 譜系定位和 分選 的重要工具。 2） 4－ 6 體節(jié)時(shí)期預(yù)定的肝臟和腸道前 體細(xì)胞在內(nèi)胚層中的細(xì)胞譜系定位。利用激光定點(diǎn)激發(fā)技術(shù)，將 sox17:Kaede 或 sox17:Dendra 轉(zhuǎn)基因魚中的單個(gè)內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色熒光細(xì)胞，然后譜系定位紅色熒光細(xì)胞在內(nèi)胚層器官中的位置。我們將以單細(xì)胞分辨率完成每一個(gè)前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的譜系定位。 2. 在 斑馬魚 預(yù)定的肝臟 或腸道 前體細(xì)胞中 特異和 差 異表達(dá)基因 的 篩選及其功能機(jī)制研 究。 1） 4－ 6 體節(jié)時(shí)期 斑馬魚預(yù)定的肝臟 、腸道 前體細(xì)胞 分選， 兩 者 之間及其分別與原腸中期內(nèi)胚層細(xì)胞 差異表達(dá)基因的芯片篩選 。 A）根據(jù)本課題第 1 部分獲得的前腸內(nèi)胚層細(xì)胞譜系定位，在 4－ 6 體節(jié)時(shí)期 的 sox17:Kae