【正文】 第六章 微生物的生長及其控制 本章的學習目的與要求 ，熟練掌握血球計數(shù)板法和平板稀釋計數(shù)法的原理和基本操作過程。 2. 理解微生物的生長規(guī)律，熟練掌握單細胞微生物的典型生長曲線定義，各個生長時期的含義和特點，并靈活運用這些知識來分析和解決一些實際問題。 3. 理解微生物的連續(xù)培養(yǎng)，掌握恒濁器連續(xù)培養(yǎng)法和恒化器連續(xù)培養(yǎng)法的定義和特點，了解連續(xù)發(fā)酵。 4. 了解影響微生物生長的主要理化因素。 5. 了解常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法，掌握常規(guī)固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法。 6. 掌握控制有害微生物的幾個重要概念；熟練掌握高溫滅菌的種類和相應的參數(shù)條件，特別是濕熱滅菌方法 (巴氏消毒法、超高溫瞬時滅菌法、連續(xù)滅菌法及高壓蒸汽滅菌法的注意事項 )；高溫滅菌對培養(yǎng)基成分的有害影響及其防止措施。 7. 了解幾種常用化學殺菌劑、消毒劑和治療劑的種類和功效，以及其殺菌、抑菌原理，熟練掌握抗代謝藥物磺胺類藥物的治療機制，抗生素的概念以及抗藥性產(chǎn)生的機理等。 個體生長 → 個體繁殖 → 群體生長 群體生長＝個體生長＋個體繁殖 生長是一個逐漸發(fā)生的量變的過程，是繁殖的基礎；繁殖是一個質(zhì)變的過程，是生長的結(jié)果。 生長： 指細胞物質(zhì)有規(guī)律、不可逆增加的過程。是有機體的細胞組分與結(jié)構在量方面的增加。 繁殖： 是微生物生長到一定階段，由于細胞內(nèi)各種細胞結(jié)構的復制和重建，導致產(chǎn)生一個新的細胞個體，即引起細胞個體數(shù)量增加的整個生物學過程。 單細胞：由于細胞分裂引起個體數(shù)目的增加。 多細胞：通過無性或有性孢子使個體數(shù)目增加的過程。 第一節(jié) 測定生長繁殖的方法 第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律 第三節(jié) 影響微生物生長的主要因素 第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論 第五節(jié) 有害微生物的控制 （二）間接法 比濁法： 微生物培養(yǎng)物在其生長過程中，由于原生質(zhì)含量的增加，會引起培養(yǎng)物混濁度的增高。 用分光光度計在可見光的 450～ 650nm波段內(nèi)測定培養(yǎng)物的吸光度。 第一節(jié) 測定生長繁殖的方法 一、測生長量 （一）直接法 測體積：在刻度離心管中測沉降量。 —— 粗放 測干重：可用離心法或過濾法測定 ， 一般干重為濕重的 10%～20%。 —— 精確 生理指標法 —— 測定與微生物生長量相平行的生理指標 。 1) 測含氮量； 用凱氏定氮法等測其總氮量 ， 再乘以系數(shù) 6． 25即為粗蛋白含量 。 蛋白含量越高 ， 說明菌體數(shù)和細胞物質(zhì)量越高 。 2) DNA含量測定法 采用適當?shù)臒晒庵甘緞┗蛉旧珓┡c菌體 DNA作用，利用熒光比色或分光光度計法測得 DNA的含量。 3) 其他生理指標法 測定碳、磷、 RNA、 ATP、 DAP(二氨基庚二酸 ) 等的含量。 此外，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、耗氧、粘度和產(chǎn)熱等指標，有時也應用于生長量的測定。 二、計繁殖數(shù) —— 測定單細胞微生物的個體數(shù)目、絲狀微生物的孢子數(shù)。 直接計數(shù)法（全數(shù)） —— 血球計數(shù)板法 是測定一定容積中的細胞總數(shù)目的常規(guī)方法。特點是測定簡便、直接、快速，但測定的對象有一定的局限性，只適合于個體較大的微生物種類。 間接計數(shù)法（活菌數(shù)） —— 稀釋平板菌落計數(shù)法 是一種最常用的活菌計數(shù)法，包括澆注平板法和涂布平板法。 一、微生物的個體生長與同步生長 第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律 （一）細胞周期： 指從一個新細胞的產(chǎn)生到分裂出兩個子細胞的全過程。它可簡單地分為兩個相互延續(xù)的時期，即細胞分裂期和分裂間期。分裂間期是細胞增殖的物質(zhì)準備和積累階段，分裂期則是細胞增殖的實施過程。 （二）觀察微生物個體生長的方法： 通過電子顯微鏡觀察細胞的超薄切片： 同步培養(yǎng)法技術： 設法使某個群體中的所有個體細胞盡可能處于同樣細胞分裂和生長周期中，然后通過分析此群體在各階段的生物化學特性變化來間接了解單個細胞的相應變化規(guī)律。 同步生長 ： 通過同步培養(yǎng)的手段而使細胞群體中各個體處于分裂步調(diào)一致的生長狀態(tài)，稱為同步生長。 (1)環(huán)境條件誘導法： 1） 溫度調(diào)整法：亞適生長溫度 最適生長溫度培養(yǎng) 。 2） 營養(yǎng)條件調(diào)整法：控制濃度或組成 ， 使細胞只能進行一次分裂 。 3） 用穩(wěn)定期的培養(yǎng)物接種：穩(wěn)定期細胞處于衰老狀態(tài) ，移入新鮮培養(yǎng)基 ， 可得同步生長 。 4） 抑制 DNA合成法： DNA合成是細胞分裂前提 。 抑制一段時間再解除抑制 (2)機械篩選法：利用物理方法從不同步的細菌群體中選擇出同步的群體 。 1)選擇性過濾法： 2)密度梯度離心法： 3)膜洗脫法某些濾膜可以吸附帶相反電荷的細胞，其過程：吸附、翻轉(zhuǎn)洗脫 同步性只能保持 2～ 3代 二、微生物的群體生長規(guī)律 （ 一 ） 微生物在分批培養(yǎng)中的生長規(guī)律： 分批培養(yǎng)即接種少量微生物在一密閉系統(tǒng)中生長繁殖，直到某些營養(yǎng)物耗盡，或有些代謝產(chǎn)物積聚到毒害濃度為止。 典型生長曲線 將少量純種單細胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在適宜條件下，其群體就會有規(guī)律地生長，定時取樣測定細胞含量，以細胞數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標，以培養(yǎng)時間作橫坐標，就可以畫出一條有規(guī)律的曲線，這就是微生物的典型生長曲線。 意義：描述單細胞微生物從生長開始到衰老死亡的一般規(guī)律。 適用對象： 單細胞微生物：細菌、酵母 不適合絲狀生長的真菌或放線菌 典型生長曲線的分期及各分期的意義 (1)延滯期 (停滯期 、 調(diào)整期 )： 是指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液中后 ， 在開始培養(yǎng)的一段時間內(nèi) ， 細胞數(shù)目不增加的時期 。 1)特點： ； 生長速率常數(shù)：每小時的分裂代數(shù) 。 ； RNA尤其是 rRNA含量增高 ， 原生質(zhì)呈嗜堿性 。 ， 核糖體 、 酶類和 ATP的合成加速 ， 易產(chǎn)生各種誘導酶 ； 。 3) 縮短延滯期的手段： a. 以對數(shù)期的菌體作種子菌 ； b. 適當增大接種量 ：一般采用3%8%的接種量，根據(jù)生產(chǎn)上的具體情況而定，最高不超過1/10。 2) 形成原因：調(diào)整代謝，合成新的酶系和中間代謝產(chǎn)物以適應新環(huán)境。 c. 培養(yǎng)基的成分：種子培養(yǎng)基盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基 。 4)實踐意義： 延滯期的長短直接影響發(fā)酵周期 ， 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中要盡量縮短延滯期 ， 選擇對數(shù)期接種齡的細胞做種子 ， 增大接種量 ， 使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基成分接近 。 (2) 對數(shù)期 log phase 又叫指數(shù)期，指微生物在培養(yǎng)過程中以幾何級數(shù)速度分裂的一段時期。在生長曲線中，緊接著延滯期后的一段時期。 1)特點：此時菌體細胞生長的速率常數(shù) R最大，分裂快，代時短，細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級數(shù)增加，群體的形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境的能力強。 2) 重要參數(shù)： n： 指數(shù)生長期愈長 ， n愈多 ， 則菌體產(chǎn)量愈高 。 X2 = X1 2n 以對數(shù)表示： lgX2 =lgX1＋ nlg2 ∴ n = (lgX2－ lgX1) R： 即每小時的分裂代數(shù)。 G： 單個細胞完成一次分裂所需時間，亦即增加一代所需時間。受菌種、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的影響。 影響微生物對數(shù)期增代時間的因素較多，主要有： 菌種 ：不同微生物代時差別大。 菌種 代時 (min) 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 2632 嗜酸乳桿菌 6687 乳酸鏈球菌 2648 金黃色葡萄球菌 2730 結(jié)核分枝桿菌 792932 活躍硝化桿菌 1200 釀酒酵母 120 營養(yǎng)成分 ： 同種微生物，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其代時就短，反之則長。 營養(yǎng)物濃度 ：很低時影響。 固定環(huán)境條件，其他必需營養(yǎng)都過量，改變其中一特定生長必需底物的濃度，與比生長速度的關系可用 Monod公式表示： SKsSm??.??式中： m? 為最大比生長速度； S為限制生長底物濃度； Ks為比生長速度是最大比生長速度一半時的底物濃度； 當 SKs時， KsSm .?? ?當 KsS時， m?? ?生長限制因子： 凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物，就稱生長限制因子。 營養(yǎng)濃度對生長速度和菌體產(chǎn)量的影響 培養(yǎng)時間 不同營養(yǎng)物濃度水平 只有最大收獲量受影響 生長速度和最大收獲量受影響 細胞數(shù)或菌