【正文】 動物實驗設(shè)計與實施 南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心 第一部分：動物實驗設(shè)計和實施的基本過程 一、選擇研究題目 廣義的選擇 狹義的選擇 政府法規(guī)需要 正確選題應(yīng)遵守的幾個 基本原則 ； 科學(xué)性：是指選題應(yīng)建立在前人的科學(xué)理論和實驗基礎(chǔ)上，而不是毫無根據(jù)的胡思亂想。 目的性：指選題應(yīng)具有明確的理論意義和實踐意義，要能解決具體問題。 創(chuàng)造性：指選題應(yīng)具有自己獨到之處，或提出新規(guī)律、新見解、新技術(shù)、新方法，或是對舊有的規(guī)律、技術(shù)、方法有所修改、補充。 可行性：是指選題應(yīng)切合研究者的學(xué)術(shù)水平、技術(shù)水平和實驗條件，還要結(jié)合研究者的工作基礎(chǔ)，使實驗?zāi)軌蝽樌麑嵤? 二、提出假說 假說提出的一般過程 ： 觀察和記錄所有相關(guān)的信息（包括研究者已開展的初步實驗結(jié)果） 分析和歸類這些信息 在這些信息的基礎(chǔ)上提出假說 ? 假說是預(yù)先假定的答案或解釋，亦既是實驗的預(yù)期結(jié)果。對于動物實驗研究來說，假說是十分必要的。假說是實驗研究設(shè)計的前提，如果沒有假說，實驗和觀察就失去目標(biāo)。假說關(guān)系著實驗研究的目的性、計劃性和預(yù)見性。 ? 對假說既應(yīng)努力加以驗證，又應(yīng)適時加以拋棄 ，重新建立新的假說，再加以驗證。這樣才有可能使正確的假說上升為結(jié)論、原理和學(xué)說。 ? 研究者開展動物實驗前，應(yīng)在熟悉有關(guān)實驗動物理論知識和動物實驗技能的基礎(chǔ)上，積極進行邏輯思維，結(jié)合實際條件，提出創(chuàng)新性課題和大膽的假說。 三、選擇研究材料 主要是用于制作實驗需要的動物模型 1. 常規(guī)品種（系） 2. 特殊品種（系）：疾病模型動物、轉(zhuǎn)基因品系等 3. 高峰期 4. 特殊規(guī)格： F乳鼠等 5. 外購：外地、外國、非商業(yè)性單位等 四、準(zhǔn)備研究方案 示意性的實驗設(shè)計，包含了實驗過程中的各種處理 對實驗操作過程的解說和測量方法的描述 簡述可能對動物造成的不適 應(yīng)用動物的 例數(shù) 和所用的 統(tǒng)計學(xué)方法 都應(yīng)當(dāng)加以說明 簡述實驗準(zhǔn)備情況，包括準(zhǔn)備的方法、過程和分析的資料 實驗中的一些實際情況：人員需求、實驗負(fù)責(zé)人姓名、所需經(jīng)費 實驗方法的選定 ? 實驗方法按學(xué)科可分為生理學(xué)方法、生物化學(xué)方法、生物物理方法、免疫學(xué)方法等； ? 按性質(zhì)可分為形態(tài)學(xué)方法、機能學(xué)方法 ? 按范圍可分為整體綜合方法和局部分析方法 ? 按水平分： 整體水平、器官水平、細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平、分子水平和量子水平等。 無論選用何種實驗方法，均應(yīng)保證以下幾點 : ? 可靠性：即切實可行，穩(wěn)定可靠，是大家公認(rèn)的方法，也即是經(jīng)典方法。 ? 優(yōu)越性：指實驗方法既具先進的一面，又便于與其它實驗方法相互配合，故也稱先進性和協(xié)同性。 ? 創(chuàng)造性：即實驗方法的創(chuàng)新和改良。 例： 外源基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞體內(nèi)移植研究測定方法： 1. 整體水平：測定體液的生理生化指標(biāo) 2. 細(xì)胞和亞細(xì)胞水平：光鏡和電鏡觀察 3. RNA水平： ? 原位雜交法測定 mRNA ? RTPCR法半定量測定 RNA表達量 ? Northern法定量測定。 4. 蛋白水平： ? 免疫組化與生物體視學(xué)結(jié)合 ? Western blotting定量測定 ? Elisa法測蛋白活性 五、 動物實驗前的條件準(zhǔn)備 主要內(nèi)容：準(zhǔn)備好實驗儀器、藥品、試劑和實驗動物。 實驗條件的準(zhǔn)備 要求是盡可能使實驗手段和實驗方法標(biāo)準(zhǔn)化。 ? 實驗儀器 必須校準(zhǔn)，必須事先熟悉儀器使用方法。 a、 還要和相關(guān)科室聯(lián)系，達到部分儀器共享使用的目的。同時注意某些學(xué)科不太常用的儀器設(shè)備是否存在，是否會影響實驗指標(biāo)的檢測； b、 測定動物生理、生化、生物電和器官功能指標(biāo)的各種分析儀器和描記儀，如半導(dǎo)體測溫計、動物血壓表、多導(dǎo)生理記錄儀等設(shè)備。 ? 藥品 的純度應(yīng)有明確要求，試劑的配制必須嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，尤其是麻醉劑的使用。 ? 器械 準(zhǔn)備、實驗場所消毒與器具配套等也要落實，特殊器械是否準(zhǔn)備：如顯微外科或眼科手術(shù)器械。 實驗動物的準(zhǔn)備 1. 購入或領(lǐng)取實驗動物前，應(yīng)進行各項計劃的核實，檢查各項實驗前的準(zhǔn)備工作，如動物籠盒數(shù)量、飼養(yǎng)室衛(wèi)生及消毒情況。 2. 購入或領(lǐng)取實驗動物時，應(yīng)向供應(yīng)部門索取所用動物的遺傳背景和微生物控制質(zhì)量資料、以及動物品系、年齡、體重、胎次等資料。 3. 根據(jù)實驗觀察時間長短的需要，同時購入或領(lǐng)取相應(yīng)數(shù)量的 飼料和墊料 。 4. 若是從外地購入動物需長途運輸時，還應(yīng)考慮到途中各種因素對動物的影響，如運輸環(huán)境的溫度，濕度、飲食。尤其注意途中污染和窒息死亡以及應(yīng)激反應(yīng)等問題。應(yīng) 隔離檢疫 并提供 3周左右的動物適應(yīng)期。 5. 若是購入或領(lǐng)取清潔級以上實驗動物，應(yīng)采用帶有空氣過濾膜的無菌運輸罐或帶有濾帽的籠盒運輸，嚴(yán)格檢查其密封狀況。 6. 術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前 3天單籠飼養(yǎng)，術(shù)前 8－ 24小時禁食、禁水。 六、預(yù) 實 驗 是在動物實驗前對正式實驗進行初步實驗。目的在于檢查各項準(zhǔn)備工作是否完善，實驗方法和步驟是否切實可行，測試指標(biāo)是否穩(wěn)定可靠，初步了解實驗結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的距離，從而為正式實驗提供補充、修正的意見和經(jīng)驗，是動物實驗必不可少的重要環(huán)節(jié)。預(yù)實驗可用少量動物進行， 實驗方法和觀測指標(biāo)應(yīng)該和正式實驗一樣 ，但預(yù)實驗的結(jié)果不能歸入正式實驗的最后結(jié)果中一同分析。 預(yù)實驗一樣要得到倫理委員會的審批才可實施。 七、實驗的詳盡方案和實施 需要準(zhǔn)備一個動物實驗的日程表，寫上簡單明了的實驗方案，實驗過程應(yīng)該描述清楚，注明對實驗動物品種、品系的選擇，動物的營養(yǎng)、飼喂方式和時間的選擇， 樣本的采集 和 安樂死 的方式。 詳細(xì)的草案還應(yīng)該包括實驗者、實驗動物和實驗技術(shù)等幾個方面的問題。實驗技術(shù)如 給藥途徑和方法 、術(shù)式、 麻醉方法 和深度、復(fù)蘇和搶救措施等。 實驗結(jié)束時收集所有的實驗資料，進行各種后續(xù)指標(biāo)的檢測，包括運用數(shù)學(xué)統(tǒng)計的方法分析處理實驗數(shù)據(jù)。 分析結(jié)果是否證明了原來的假設(shè)。 八、評估和報告 標(biāo)題和實驗者：包括所有參與實驗研究的人員。 摘要：簡要介紹實驗研究的目的、實驗設(shè)計、實驗方法和結(jié)論。 導(dǎo)論：簡單地介紹相關(guān)的背景知識、國內(nèi)外類似研究現(xiàn)狀，提出可能的假設(shè)。如果假設(shè)不成立的話陳述一下預(yù)期的結(jié)果。 材料和方法： 實驗結(jié)果：通過圖形、表格和文字等將實驗結(jié)果展示出來，文字要簡介扼要。 實驗結(jié)論：簡單扼要的得出實驗結(jié)論，說明假設(shè)被證明的情況和取得的科研成果，為將來的研究提出好的建議。 致謝 參考文獻 第二部分：動物實驗組織和管理 概 論 使用實驗動物進行生物醫(yī)學(xué)研究計劃不是一個人能夠?qū)嵤┑?，是一個涉及很多人、復(fù)雜的研究過程。動物實驗研究需要各種人員進行適當(dāng)?shù)?分工、配合。 ?研究人員設(shè)計、組織和實施動物實驗和經(jīng)費管理，撰寫研究報告； ?有動物實驗資格的技術(shù)員按照實驗設(shè)計進行具體的實驗操作； ?動物飼養(yǎng)員日常飼喂、管理； ?實驗動物管理委員會檢查實驗中動物的福利是否得到保障、實驗方法是否人道等。 一、關(guān)于動物實驗的法律、法規(guī)和相關(guān)要求 動物實驗方案是否符合國家法律？在很多國家，不是所有關(guān)于動物實驗的方案都可以實施。 所利用的動物實驗研究機構(gòu)是否是政府部門認(rèn)可的有權(quán)進行動物實驗的機構(gòu)。 研究人員進行動物實驗設(shè)計和實施的資格。 是否有充分的理由解釋使用動物進行研究的必要性。 是否有足夠的專業(yè)人員（飼養(yǎng)員、技術(shù)員等）來保證實驗順利進行。 實驗動物的來源是否合法，是否符合實驗動物的各種標(biāo)準(zhǔn)化控制條件。 是否與當(dāng)?shù)氐膭游锔＠麢C構(gòu)有了溝通。 研究計劃的進行是否得到實驗管理委員會的批準(zhǔn)。 是否有完整的實驗記錄。 實驗動物管理委員會（ IACUC） 實驗動物福利和倫理管理委員會 二、動物實驗的影響因素的控制 要盡可能滿足下列條件，使實驗和動物的變異降到最小。 一、動物因素 種屬、品種、品系、年齡、體重及性別、生理狀態(tài)、健康狀況 二、環(huán)境因素 溫、濕度、氣流、潔凈度、光照、噪聲、營養(yǎng)、飼喂、環(huán)境微生物 三 、 技術(shù)因素 實驗季節(jié)、晝夜過程、麻醉深度、手術(shù)技巧、用藥途徑和方法等 三、相關(guān)規(guī)范、規(guī)程和認(rèn)證 優(yōu)良實驗室操作規(guī)范 GLP（ Good Laboratory Practice, GLP)是國際上通用的具有良好的質(zhì)量管理規(guī)范的簡稱，是藥品安全性評價過程中就組織管理、項目實施、記錄報告、資料保存等方面所制定的法規(guī)，其目的在于保證藥品安全性評價的完整性、可靠性和重復(fù)性。盡管 GLP最初目標(biāo)是為了保證動物實驗在藥物毒性研究中的準(zhǔn)確性，將 GLP規(guī)則推廣到其它涉及動物實驗的研究領(lǐng)域中，有利于這些研究項目的標(biāo)準(zhǔn)化，增加實驗結(jié)果的重復(fù)性。當(dāng)然，GLP規(guī)則并不能適合所有的動物實驗研究，因為每一類型的動物實驗對于標(biāo)準(zhǔn)化都有其自身特殊的意義。 藥物安全性評價實驗包括 ：單次給藥毒性試驗、反復(fù)給藥毒性試驗、生殖毒性試驗、遺傳毒性試驗、致癌試驗、局部毒性試驗、免疫原性試驗、安全性藥理試驗、依賴性試驗、毒代動學(xué)試驗等。 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 SOP（ Standard Operating Procedure, SOP） : 為有效地實施和完成某一試驗研究中每項工作所擬定的標(biāo)準(zhǔn)和詳細(xì)的書面規(guī)程。 針對動物實驗研究主要的 SOP規(guī)范有：對動物飼養(yǎng)、衛(wèi)生、實驗技術(shù)、觀測方法、動物檢查、數(shù)據(jù)收集和處理等都要有標(biāo)準(zhǔn)的 SOP操作規(guī)程。 1. 動物分組與識別的 SOP、 2. 飼養(yǎng)管理 SOP、 3. 觀察記錄及實驗操作的 SOP、 4. 動物尸檢以及組織病理學(xué)檢查處理的 SOP、 5. 動物尸體及其他廢棄物處理的 SOP、 6. 實驗標(biāo)本的采集、 7. 編號和檢驗的 SOP、 8. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理的 SOP、 9. 資料檔案管理 SOP等 AAALAC認(rèn)證 實驗動物管理評估和認(rèn)證協(xié)會（ Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC） :非贏利的私人組織，權(quán)威的評估和認(rèn)證動物飼養(yǎng)和使用標(biāo)準(zhǔn)的國際機構(gòu)，它要求人道、科學(xué)地對待動物。 FDA和歐盟 強力推薦在有 AAALAC認(rèn)證的實驗室開展的動物實驗。 世界 500強醫(yī)藥巨頭 聯(lián)合申明，他們醫(yī)藥產(chǎn)品的動物實驗都將在 AAALAC認(rèn)證單位完成。 AAALAC認(rèn)證在世界范圍內(nèi)享有很高的聲譽，為實驗動物領(lǐng)域樹立了高標(biāo)準(zhǔn)的楷模。 （目前世界上已有 29個國家的 770多個機構(gòu)通過了 AAALAC認(rèn)證。中國有 12個機構(gòu)通過了 AAALAC認(rèn)證， 廣東地區(qū)廣州醫(yī)工院通過 Beagle犬認(rèn)證 ） 廣西食蟹猴 實驗動物研發(fā)基地 廣西 ：南寧國家高新區(qū)投資建成了“ 廣西南寧國際靈長類動物模型與醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化示范基地 ”，是國內(nèi)第一家通過國際資質(zhì)認(rèn)證的靈長類實驗動物室 四、動物實驗集中化 ? 實驗動物供應(yīng)室：進行實驗動物生產(chǎn)、采購、飼養(yǎng)、檢疫。 ? 實驗動物旅館：除了第一類服務(wù)范圍外，還可以安置、喂養(yǎng)不常用動物或需要特殊安置的動物。如羊、犬、靈長類等。但是如果進行外科手術(shù)、 X射線、胃鏡等檢測時還需要更換地方進行相關(guān)項目檢查。 ? 動物實驗中心；是動物實驗集中化的最高形式，基本可以滿足一站式服務(wù)。 我校的動物實驗設(shè)施 南方醫(yī)科大學(xué)東莞松山湖 實驗動物科技園 東莞松