【正文】 RNA Transcription amp。 Regulation 袁 潔 Email： 第一篇 藥學(xué)分子生物學(xué)基礎(chǔ) 中心法則 ? 生物體遺傳信息傳遞的方式 reverse transcription 中心法則（ the central dogma） ? 生物功能的實(shí)現(xiàn)（遺傳信息的表達(dá)）： 轉(zhuǎn)錄 、 翻譯 ? 世代之間傳遞： DNA的復(fù)制 DNA 成熟的 mRNA 轉(zhuǎn)錄（ transcription） ? 生物體以 DNA為模板合成 RNA的過程 轉(zhuǎn)錄是遺傳信息表達(dá)的第一步 RNA轉(zhuǎn)錄 復(fù)制 VS 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的 共同點(diǎn) ?核苷酸聚合反應(yīng)，生成磷酸二脂鍵 ?以 DNA為模板 ?酶 促反應(yīng) ?遵從 堿基配對(duì) 規(guī)律 ?方向：從 5’→ 3’ 轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的 區(qū)別 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 兩股鏈均復(fù)制 模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄） 原料 dNTP NTP 引物 需要 RNA做引物 不需要 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 配對(duì) AT, CG AU, TA, GC 產(chǎn)物 子代雙鏈 DNA （半保留復(fù)制） mRNA, tRNA， rRNA, small RNA 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì) ? 原料：核苷酸（ NTP： ATP, UTP, GTP, CTP） ? 模板： DNA ? 酶： RNA聚合酶（ RNA polymerase, RNApol） ? 轉(zhuǎn)錄因子（ transcription factor, TF） ? 凡是轉(zhuǎn)錄過程必需的蛋白質(zhì)，只要它不是 RNA聚合酶的組成成分，就可以將其定義為轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄的模板 ? 結(jié)構(gòu)基因（ structural gene） : DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段 轉(zhuǎn)錄的模板 ? 結(jié)構(gòu)基因（ structural gene） : DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段 ? 模板鏈 (template strand)，也稱作 有意義鏈 或Watson鏈 DNA雙鏈中，按堿基配對(duì)規(guī)律，能指引轉(zhuǎn)錄生成 RNA的一股單鏈 轉(zhuǎn)錄的模板 ? 結(jié)構(gòu)基因（ structural gene） : DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段 ? 模板鏈 (template strand)，也稱作 有意義鏈 或Watson鏈 ? 編碼鏈 (coding strand)，也稱為 反義鏈 或 Crick鏈 。 與模板鏈互補(bǔ)的鏈，特征是與轉(zhuǎn)錄的 RNA序列類似（僅有 T與 U的區(qū)別） 模板鏈、編碼鏈與 RNA的關(guān)系 5′GCAGUACAUGUC 3′ mRNA NAla Val His Val C 肽 轉(zhuǎn)錄 翻譯 5′GCAGTACATGTC 3′ 3′ c g t g a t g t a c a g 5′ 編碼鏈 模板鏈 DNA 參與轉(zhuǎn)錄 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄 (asymmetric transcription) ? 在 DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄 ； 5? 3? 3? 5? 模板鏈 編碼鏈 編碼鏈 模板鏈 轉(zhuǎn)錄方向 轉(zhuǎn)錄方向 結(jié)構(gòu)基因 ? 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。 基本內(nèi)容： ? 第一節(jié)：原核生物的轉(zhuǎn)錄 ? 第二節(jié)：真核生物的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾 ? 第三節(jié)：轉(zhuǎn)錄調(diào)控（原核、真核） 原核的 RNA聚合酶 基因 產(chǎn)物 功能 rpoA 2α 聚合酶 啟動(dòng)子識(shí)別 結(jié)合激活劑 rpoB β 與轉(zhuǎn)錄全過程相關(guān) rpoC β’ 結(jié)合 DNA模板 rpoD σ 辨認(rèn)正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 核心酶 （ core polymerase） 全酶 （ holoenzyme） 核心酶 (core enzyme) 全酶 (holoenzyme) ?? ? ? ? ? ?? ? ? ? 原核的 RNA聚合酶 核心酶與 σ亞基 ? 原核 RNA聚合酶的 σ亞基能識(shí)別啟動(dòng)子 ? σ亞基 在轉(zhuǎn)錄開始后 脫離核心酶 ? 核心酶 完成后續(xù)的轉(zhuǎn)錄過程 35區(qū) 10區(qū) 圖 113 原核生物的 RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合 （ DNA雙鏈已打開， σ因子尚未脫落） 啟動(dòng)子 (promoter) ? 啟動(dòng)子 :RNA聚合酶結(jié)合模板 DNA的部位 5?3? 3?5? 結(jié)構(gòu)基因 調(diào)控序列 RNApol 原核 RNA聚合酶的 σ亞基能識(shí)別啟動(dòng)子 RNA聚合酶保護(hù)法 一種巧妙的研究啟動(dòng)子序列的方法 4060bp的 DNA片段沒有被降解，暗示 ——DNA與RNA聚合酶結(jié)合的部位 原核生物啟動(dòng)子保守序列 開始轉(zhuǎn)錄 (Pribnow box) T A T A A T Pu A T A T T A Py 10 區(qū) T T G A C A A A C T G T 35 區(qū) RNApol辨認(rèn)位點(diǎn) (recognition site) 5? 5? 結(jié)構(gòu)基因 3? 3? RNA聚合酶保護(hù)區(qū) 1 30 50 10 10 40 20 5 ? 3 ? 3 ? 5 ? 轉(zhuǎn)錄的過程 ? 轉(zhuǎn)錄起始 ? RNA的延長(zhǎng) ? 轉(zhuǎn)錄終止 原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的聚合酶、起始、終止都有所不同 原核生物轉(zhuǎn)錄的過程 ? 轉(zhuǎn)錄起始 需解決兩個(gè)問題： 1. RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。 2. DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。 原核生物的 轉(zhuǎn)錄起始 ? RNA聚合酶全酶 (?2????)與模板結(jié)合 ? DNA雙鏈解開 ? 在 RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 5?pppG OH + NTP ? 5?pppGpN OH 3? + ppi ? 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 : RNApol (?2????) DNA pppGpN OH 3? 原核生物 轉(zhuǎn)錄的延伸 ? ?亞基脫落， RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著 DNA模板前移 ? 在 核心酶 作用下， NTP不斷聚合， RNA鏈不斷延長(zhǎng) (NMP) n + NTP ?? (NMP) n+1 + PPi 轉(zhuǎn)錄空泡 (transcription bubble) 轉(zhuǎn)錄空泡 非模板 DNA RNA聚合酶 RNADNA雜化雙鏈，～ 12bp RNA 解開雙鏈 模板鏈DNA 恢復(fù)雙鏈 5’ 3’ 轉(zhuǎn)錄方向 超螺旋是轉(zhuǎn)錄的一個(gè)重要特征 ? 隨著 RNApol沿雙鏈前進(jìn)，它的前方產(chǎn)生正超螺旋（ DNA更加緊密），后方產(chǎn)生負(fù)超螺旋（ DNA部分解鏈） ? 兩種螺旋都可以通過促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶去除。 ? 類似 DNA復(fù)制的時(shí)候 原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸 原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象 5? 3? DNA 核糖體 RNA RNA聚合酶 電子顯微鏡照片 轉(zhuǎn)錄未完成，翻譯已經(jīng)在進(jìn)行著 原核生物 轉(zhuǎn)錄終止 指 RNA聚合酶在 DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來。 ? 依賴 Rho (ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止 ? 非依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止 分類： 依賴 Rho因子 的轉(zhuǎn)錄終止 A T P ρ因子： ? 1969年 Roberts在被 T4噬菌體感染的 E. coli 中發(fā)現(xiàn) ? 與 RNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，改變 RNApol構(gòu)象，使其停頓 ? 有 ATP酶活性，解旋酶（ helicase）活性 非依賴 Rho因子 的轉(zhuǎn)錄終止 DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出 RNA后， RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` AGCCUUUUU 3` RNA 5?TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3? DNA UUUU...… UUUU...… CUUUUU CCUUUUU 莖環(huán) (stemloop)/發(fā)夾 (hairpin)結(jié)構(gòu) 莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理 ? 回文序列導(dǎo)致 RNA形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) ? 改變了 RNApol的構(gòu)象，使其停頓 ? RNA和 DNA各自形成雙鏈，使 RNA/DNA雜化短鏈分開，釋放 RNA RNA聚合酶 ? 原核生物只有 1種 RNA聚合酶 催化合成 mRNA、 tRNA和 rRNA ? 真核生物具有 3種不同的 RNA聚合酶RNA聚合酶 Ⅰ (RNApolⅠ ) RNA聚合酶 Ⅱ (RNApolⅡ ) RNA聚合酶 Ⅲ (RNApol Ⅲ ) RNA聚合酶 ? 真核生物的 RNA聚合酶 種類 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 對(duì)鵝膏蕈堿 的反應(yīng) 45S rRNA hnRNA 5S rRNA tRNA snRNA 耐受 極敏感 中度敏感 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 真核生物的 轉(zhuǎn)錄起始 真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子（轉(zhuǎn)錄因子）的協(xié)助，它們與 RNA聚合酶 Ⅱ 形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，也是當(dāng)今生命科學(xué)研究熱點(diǎn)。了解真核生物的轉(zhuǎn)錄過程，是研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要基礎(chǔ)。 轉(zhuǎn)錄起始上游的 DNA序列 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) TATA盒