【正文】 內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 1 第一章 緒 論 引言 目前，全世界的醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)已有一半以上由生物技術(shù)合成，其中，抗生素、維生素、激素這三大類藥物主要由微生物發(fā)酵生產(chǎn)。抗生素在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用十分廣泛，從而有效地控制了許多傳染疾病，同時(shí)也促進(jìn)了發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。 土霉素化學(xué)式及性狀 土霉素 (Terramycin)又稱地霉素、氧四環(huán)素 (Oxytetracycline)，化學(xué)名：(4s,4аR,5S,5аR,6S,12аS)N4二甲胺基 1,4,4а,5,5а,6,11,12а八氫 ,5, 6,10,12,12а六羥 基 6甲基 1,11二氧代并四苯 2甲酰胺，是四環(huán)素類抗生素的一種，因結(jié)構(gòu)上含有四并苯基的母核而得名。化學(xué)式如下： 本品為灰白色至黃色的結(jié)晶粉末，無臭，味苦，熔點(diǎn)是 180℃ ，在空氣中性質(zhì)穩(wěn)定，在日光下顏色變暗在堿性溶液中易破壞失效。土霉素的鹽酸鹽為黃色結(jié)晶，味苦，熔點(diǎn) 190～ 194℃ ，有吸濕性，但水分和光線不影響其效價(jià)，在室溫下長(zhǎng)期保存不變質(zhì)，不失效。鹽酸鹽易溶于水，溶于甲醇，微溶于無水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性條件下不穩(wěn)定。添加到飼料中，在室溫下保存四個(gè)月，效價(jià)下降 4%～ 9%，制 粒時(shí)效價(jià)下降 5%～ 7%。 作用機(jī)理 本品為廣譜抑菌劑，能特異性地與細(xì)菌核糖體 30S 亞基的 A 位置結(jié)合，抑制肽鏈的增長(zhǎng)和影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，能抑制動(dòng)物腸道內(nèi)的有害微生物，激活大腸中有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成的微生物。可使動(dòng)物腸壁變薄，更有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)說明書 2 吸收和利用，從而提高腸道吸收效率。許多立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、螺旋體、阿米巴原蟲和某些瘧原蟲也對(duì)本品敏感。腸球菌屬對(duì)其耐藥。其他如放線菌屬、炭疽桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、梭狀芽孢桿菌、奴卡菌屬、弧菌、布魯菌屬、彎曲桿菌、耶爾森菌等對(duì)本品敏感。 土霉素為四環(huán)類抗生素，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本較低，可作為生產(chǎn)其它新型抗生素的原料。 土霉素價(jià)格低廉，可以作為飼料添加劑用于養(yǎng)殖業(yè)。實(shí)踐表明：土霉素用于飼料添加劑，可以改善飼料轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高畜禽抗疾病能力。 土霉素對(duì)多數(shù)革蘭氏陽性菌 (如肺炎球菌，溶血性鏈球菌，草綠色鏈球菌以及部分葡萄糖球菌，炭疽桿菌 )和革蘭氏陰性菌 (如大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌，破傷風(fēng)，肺炎桿菌，流感桿菌，百日咳桿菌等 )均有抗菌作用。臨床上主要用于肺炎、敗血癥、斑疹、傷寒了、淋巴肉芽腫、砂巖及其他細(xì)菌性感染等，對(duì)傷 寒有效，也可用于阿米巴痢疾和陰道滴蟲病患者。此外還能抑制立克次體和砂巖病毒及淋巴肉芽腫病毒 。 作為抗生素，上世紀(jì)六七十年代時(shí)，土霉素曾在抗菌藥市場(chǎng)上占重要地位，但伴隨著其它多種高效抗生素的誕生與發(fā)展，土霉素市場(chǎng)快速走向衰落。目前，土霉素已經(jīng)極少用于臨床了。 土霉素的生產(chǎn) 土霉素通常由龜裂鏈絲菌 (streptomyces rimosus)發(fā)酵得到，目前國(guó)內(nèi)提取工藝一般以草酸 (或部分鹽酸替代草酸 )作酸化劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液 pH 值，利用黃血鹽鈉和硫酸鋅作凈化劑生成普魯士藍(lán)沉淀協(xié)同去除 Fe3+及高分子雜質(zhì)，再 經(jīng) 1222 樹脂脫色，調(diào)節(jié) pH 至 晶得干燥到土霉素成品 [1]。 3 設(shè)計(jì)目標(biāo)任務(wù) 本設(shè)計(jì)主要內(nèi)容為：了解土霉素生產(chǎn)中的原料預(yù)處理、發(fā)酵、提取部分的生產(chǎn)方法和生產(chǎn)流程，根據(jù)實(shí)際情況來選擇發(fā)酵工段合適的生產(chǎn)流程，并對(duì)流程中的原料進(jìn)行物料衡算、最后，畫出發(fā)酵工段的工藝流程圖。 本次設(shè)計(jì)的基本內(nèi)容 設(shè)計(jì)年產(chǎn) 400 噸土霉素生產(chǎn) 發(fā)酵工段工藝設(shè)計(jì) 。 第二章 工藝流程設(shè)計(jì) 土霉素發(fā)酵工藝流程 菌種的保藏 菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷凍干燥法。 斜面菌 種低溫保藏法：利用低溫對(duì)微生物生命活動(dòng)有抑制作用的原理進(jìn)行保藏。把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入 4～ 5℃ 冰箱中。保藏時(shí)間一般不超過 3 個(gè)月，到時(shí)必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。 砂土管保藏法：將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。保藏期 1～ 10 年。 甘油封藏法：向培養(yǎng)好的菌種斜面上，加入滅菌甘油，高出斜面 1cm，然后蠟封管口，放入冰箱。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保藏期 1～ 2 年。 真空冷 凍干燥法：是目前比較理想的一種方法。在低于 15℃ 下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華致干。在此環(huán)境中，微生物的生長(zhǎng)和代謝都暫時(shí)停止，不易發(fā)生變異，故可長(zhǎng)時(shí)間保存，一般為 5～ 10 年，最多可達(dá) 15 年之久。此法兼?zhèn)淞说蜏?、干燥及缺氧幾方面條件，使微生物可以 4 保存較長(zhǎng)時(shí)間，但過程較麻煩，需要一定的設(shè)備。 孢子的制備 這是發(fā)酵工序的開端，是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。抗生素產(chǎn)量和成品質(zhì)量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關(guān)系。生產(chǎn)用的孢子需經(jīng)過純種和生產(chǎn)能力的檢驗(yàn)，符合規(guī)定的才能用來制備種子。保 藏在砂土管或冷凍干燥管仲的菌種經(jīng)無菌手續(xù)接入又麩皮、瓊脂和水組成的斜面培養(yǎng)基中，在 ℃ 、 50%相對(duì)濕度的條件下培養(yǎng) 45 天，挑選菌落正常的孢子作為種子。在孢子制備的過程中，蒸餾水中可適當(dāng)添加 %MgSO %KH2PO4及 %(NH4)2HPO4，避免水質(zhì)波動(dòng)對(duì)孢子質(zhì)量的影響，還可以縮短孢子的成熟期。 種子制備 種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過程，其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。種子培養(yǎng)基的成分基 本與發(fā)酵培養(yǎng)基近似，培養(yǎng) 30℃ 、 30 小時(shí)左右培養(yǎng)液趨于濃厚并轉(zhuǎn)為黃色。 pH 一般在 時(shí)可以移入下一級(jí)罐。移入發(fā)酵罐時(shí) pH，效價(jià)在800u/ml 左右。種子罐級(jí)數(shù)是在指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。土霉素種子制備一般為二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基介紹 培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長(zhǎng)、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì) 量和產(chǎn)量等。土霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機(jī)鹽及金屬離子、添加前體、消泡劑五部分組成。 生產(chǎn)上曾以單糖 —葡萄糖、雙糖 —飴糖、及多糖 —秈米粉、玉米粉及淀粉的解酶液作為碳源。本設(shè)計(jì)采用淀粉作為碳源，發(fā)酵相對(duì)容易控制。 5 由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機(jī)氮源含有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會(huì)產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導(dǎo)致染菌的后果。采用植物油消沫仍舊是個(gè)好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用泡敵代替豆油。 滅菌 滅菌指的是用化 學(xué)或物理的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中所有的有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝流程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌和介質(zhì)過濾除菌等幾種。 在土霉素的生產(chǎn)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過濾除菌的方法。 發(fā)酵 這一過程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。接種量一般為 20%。發(fā)酵周期一般為 194 小時(shí) 。發(fā)酵全程 3031℃ 分段培養(yǎng)，通氣量為 。當(dāng)接種后發(fā)酵 pH低于 時(shí)開始通氨，培養(yǎng) 2040 小時(shí)，每 4 小時(shí)補(bǔ)一次，每次 1015L，控氨水平在 45mg/100ml 以上。根據(jù)發(fā)酵液殘?zhí)侵笛a(bǔ)入總糖，一般在 100 小時(shí)前殘?zhí)强刂?%%， 100 小時(shí) 150 小時(shí)控制 %%， 150 小時(shí)至放罐前 6 小時(shí)控制在 %。在整個(gè)過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行生化分析和無菌試驗(yàn)，觀察代謝變化、抗生素產(chǎn)生情況和有無雜菌污染。 土霉素的提取生產(chǎn)工藝 流程及各單元操