熒光定量pcr的原理及其應(yīng)用(已修改)
2025-05-28 14:14 本頁(yè)面
【正文】 熒光定量 PCR的原理及其應(yīng)用 蔣昌龍 熒光定量 PCR Outline ? 熒光定量 PCR的原理 ? 熒光定量 PCR應(yīng)用 PCR 反應(yīng)過(guò)程 5’ 5’ 3’ 3’ Taq 酶 Primers 反應(yīng)組分 變 性 延 伸 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 重 復(fù) 退 火 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 循環(huán) 2 4個(gè)拷貝 循環(huán) 3 8個(gè)拷貝 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ Cycle Theoretical Real Life Log Target DNA PCR反應(yīng)模式 同一樣品 96復(fù)孔的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 熒光定量 PCR 原理 缺憾 ?無(wú)法對(duì)初始模板精確定量 ?無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況 ?跑膠繁瑣、易污染 常規(guī) PCR 電泳鑒定 熒光定量 PCR ? 在體系中引入熒光染料 ? 實(shí)時(shí)檢測(cè) ?擴(kuò)增階段： 指數(shù)期 平臺(tái)期 熒光定量 PCR 原理 熒光定量 PCR 原理 Threshold line C(t) value ? 閾值 ：熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn) ? C(t)值 ：熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù) 熒光定量 PCR 原理 X=X0(1+Ex)n log X=log X0 (1+Ex)n log X0= ( log(1+Ex) )*n+ log X log X0= ( log(1+Ex) )*C(t) + log Xc(t) n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第 n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率 初始模板的 Log10值與 Ct值呈線性關(guān)系！ 設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 熒光定量 PCR 原理 熒光強(qiáng)度 循環(huán)數(shù)曲線 初始模板量對(duì)數(shù) C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 104 103 106 105 102 10 unknown 104 103 Ct值 ?通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量 熒光定量 PCR 原理 熒光定量 PCR 原理 兩種定量方法 ? 絕對(duì)定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 ? 相對(duì)定量 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 ΔΔc(t) 法 熒光定量 PCR 原理 ? 精確定量 ? 大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測(cè) – 100 — 1010 ? 省時(shí)有效 ? 通過(guò)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ? 樣品結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲
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