最權(quán)威最齊全的pcr匯總及其原理-程序(已修改)
2025-07-26 14:38 本頁面
【正文】 RTPCRTPCR RTPCR簡介 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RTPCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染。RTPCR 原理 只要是利用相關(guān)技術(shù)提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RTPCR 過程 RTPCR可以用一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RTPCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在反轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RTPCR中，在同時為反轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，反轉(zhuǎn)錄和PCR在一直觀眾順次進行。 反轉(zhuǎn)錄酶的選擇兩種方法Money 鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶 有較強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37176。 AMV反轉(zhuǎn)錄酶 有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適溫度為42176。 合成cDNA引物的選擇 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細胞mRNA，三種都可。 一步法 RTPCR引物的選擇： 1. 隨機引物 適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應。主要用于單一模板的RTPCR反應。 兩步法 2. Oligo dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。 3. 基因特異性引物 與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。 RTPCR 影響因素 RTPCR反應受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴增的循環(huán)數(shù)等。 mM ( mM)的硫酸鎂作初步實驗。 對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。 大多數(shù)目標RNA經(jīng)40輪PCR反應就能觀察到。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數(shù)到4550次。反向PCR反向PCR 反向PCR是一種新型的基因擴增方法，它能擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR 簡介 PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。 反轉(zhuǎn)錄PCR反轉(zhuǎn)錄PCR又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR，是指擴增mRNA的一種實驗技術(shù)。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增?！ ?RTPCR反應原理反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction，RTPCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。其原理是：提取組織或細胞中的總RNA，
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