植物組織培養(yǎng)第六章植物細(xì)胞培養(yǎng)(已修改)
2025-05-26 00:24 本頁(yè)面
【正文】 第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng) 目的與要求 掌握單細(xì)胞培養(yǎng)概念，了解單細(xì)胞制備途徑，掌握單細(xì)胞培養(yǎng)繁殖的方法。掌握植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的意義和細(xì)胞株篩選方法，了解懸浮培養(yǎng)類(lèi)型及方法，清楚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用。 具有單細(xì)胞分離和培養(yǎng)基本能力，具備細(xì)胞懸浮成批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)。 細(xì)胞培養(yǎng)，即通過(guò)細(xì)胞繼代培養(yǎng)，使細(xì)胞無(wú)限增殖，并使高等植物的單個(gè)細(xì)胞，在離體培養(yǎng)條件下，通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)，再分化形成具根芽的完整植株。 第一節(jié) 單細(xì)胞培養(yǎng) 一、單細(xì)胞培養(yǎng)意義 建立單細(xì)胞無(wú)性系 對(duì)培養(yǎng)的單細(xì)胞科誘發(fā)突變 排除體細(xì)胞干擾 遺傳轉(zhuǎn)化受體的建立 二、單細(xì)胞的分離 葉組織是分離單細(xì)胞的最好材料， 機(jī)械法：葉片組織輕輕研碎，勻漿過(guò)濾或離心，得到純化細(xì)胞。 特點(diǎn)：細(xì)胞不受酶?jìng)?，不?huì)發(fā)生質(zhì)壁分離。 不適用于所有植物 酶解法：利用果膠酶處理葉片，使細(xì)胞間的中膠層發(fā)生降解，分離出具有代謝活性的細(xì)胞。 特點(diǎn)：必須對(duì)酶溶液給予滲透壓保護(hù)，防止細(xì)胞脹裂。 三、單細(xì)胞培養(yǎng)方法 （一）看護(hù)培養(yǎng)法 用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織塊來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使其生長(zhǎng)和增殖的方法。 （ 1）取處于活躍生長(zhǎng)期約 1厘米大小愈傷組織塊。 （ 2）無(wú)菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約 1厘米平方的無(wú)菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過(guò)夜。 （ 3）從懸浮培養(yǎng)物或疏松的愈傷組織上分離出單細(xì)胞，并把單細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。 （ 4）恒溫培養(yǎng)。 （二）微室培養(yǎng)法 人工制造一個(gè)小室（載玻片和蓋玻片），將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。小室可通過(guò)毛細(xì)管與外界通氣，便于觀察。 注意載玻片厚度 1mm，微室厚度最好不超過(guò) 20um，蓋玻片厚度在 ，觀察效果才好。 （三）平板培養(yǎng)法 平板培養(yǎng)法是把單個(gè)細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。 步驟： 單細(xì)胞懸浮液的制備 懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制 瓊脂培養(yǎng)基的配制 平板制作 培養(yǎng) （四）條件培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入高密度的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，一定時(shí)間后這些細(xì)胞就會(huì)向培養(yǎng)基中分泌一些物質(zhì)，使培養(yǎng)基條件化。 方法：把液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 46周的高密度細(xì)胞過(guò)濾掉，將其培養(yǎng)基制成液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)單細(xì)胞或低密度細(xì)胞群體，這樣可明顯提高單細(xì)胞培養(yǎng)物存活和分裂的能力。 第二節(jié) 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是 使離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的無(wú)菌培養(yǎng)。 建立在愈傷組織的液體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上。目前已發(fā)展到全自動(dòng)控制的大容積發(fā)酵罐的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)。為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化提供了一個(gè)獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。 愈傷組織誘導(dǎo) 材料自來(lái)水沖洗 —— 75%的乙醇擦洗 —— 將材料切成小塊（帶形成層） —— 接種到 MS+2,4D 2mg/L+CH 500mg/L+瓊脂 %,上 —— 得愈傷組織 —— 擴(kuò)大繁殖。 單細(xì)胞懸浮液的制備 愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中 —— 4r/min轉(zhuǎn)床培養(yǎng) 10d—— 140m 140m的細(xì)胞篩過(guò)篩 —— 使細(xì)胞密度達(dá)到 10 個(gè) /ml左右 —— 得單細(xì)胞懸浮液。 在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，采用生長(zhǎng)快、有效成分高、適合懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株。
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