【正文】 第十一章 工業(yè)發(fā)酵染菌的防治第一節(jié) 發(fā)酵染菌的危害發(fā)酵染菌能給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項重要工作內(nèi)容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。 所謂“雜菌”， 是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。一，染菌對不同品種發(fā)酵的影響青霉素疫苗檸檬酸谷氨酸肌苷、肌苷酸酶制劑二，不同種類的雜菌對發(fā)酵的影響青霉素發(fā)酵：污染細短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大鏈霉素發(fā)酵：污染細短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大四環(huán)素發(fā)酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大檸檬酸發(fā)酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸發(fā)酵：污染芽孢桿菌的危害最大谷氨酸發(fā)酵：最怕污染噬菌體高溫淀粉酶發(fā)酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大三，不同染菌時間對發(fā)酵的影響1，種子培養(yǎng)期染菌菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富2，發(fā)酵前期染菌雜菌與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分，干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的形成3，發(fā)酵中期染菌嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的生成4，發(fā)酵后期染菌如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。如污染嚴(yán)重，可采取措施提前放罐四，不同染菌途徑對發(fā)酵的影響種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導(dǎo)致染菌范圍擴大至所有發(fā)酵罐培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性設(shè)備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大五，染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1，對過濾的影響發(fā)酵液的粘度加大；菌體大多自溶；由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度加度。造成過濾時間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡；大幅度降低過濾收率。2，對提取的影響（1）有機溶劑萃取工藝：染菌的發(fā)酵液含有更多的水溶性蛋白質(zhì)，易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開（2）離子交換工藝：雜菌易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量3，對產(chǎn)品質(zhì)量的影響（1）對內(nèi)在質(zhì)量的影響：染菌的發(fā)酵液含有較多的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。對產(chǎn)品的純度有較大影響。（2）對產(chǎn)品外觀的影響：一些染菌的發(fā)酵液經(jīng)處理過濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會出現(xiàn)混濁，影響產(chǎn)品的外觀。六，染菌對三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費用和時間。七，發(fā)酵染菌的危害1，直接經(jīng)濟損失2，間接經(jīng)濟損失第二節(jié) 發(fā)酵過程中染菌的檢查判斷一，雜菌的檢查方法 借助適當(dāng)?shù)姆椒?，才能正確而及時地發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過過程是否污染雜菌和染菌的原因與途徑。檢查雜菌的方法，要求淮確可靠和快速，這樣才能在短時間內(nèi)獲得效果。目前生產(chǎn)上常用的檢查方法有：①顯微鏡檢查；②平板劃線檢查；③肉湯培養(yǎng)檢查。 判斷發(fā)酵是否染菌應(yīng)以無菌試驗結(jié)果為根據(jù)。無菌試驗的目的：（1）監(jiān)測培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及附屬設(shè)備滅菌是否徹底（2）監(jiān)測發(fā)酵過程中是否有雜菌從外界侵入（3）了解整個生產(chǎn)過程中是否存在染菌的隱患和死角二，各種檢查方法的比較3種方法各有優(yōu)缺點，顯微鏡檢查方法簡便、快速，能及時發(fā)現(xiàn)雜菌，但由于鏡撿取樣少，視野的觀察面也小，因此不易撿出早期雜菌。平板劃線法的缺點是需經(jīng)較長時間培養(yǎng)(一般要過夜)才能判斷結(jié)果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能撿出更少的雜菌。三，雜菌檢查中的問題1，檢查結(jié)果應(yīng)以平板劃線和肉湯培養(yǎng)結(jié)果為主要根據(jù)2，平板劃線和肉湯培養(yǎng)應(yīng)做三個平行樣3，要定期取樣4，酚紅肉湯和平板劃線培養(yǎng)樣品應(yīng)保存至放罐后12小時，確定為無菌時方可棄去5，取樣時防止外界雜菌混入的措施四，檢查的工序和時間選擇那些生產(chǎn)工序和時間的樣品檢查也是十分重要的問題?？茖W(xué)合理的選擇檢查工序和時間，對于除去已污染雜菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有著直接的指導(dǎo)意義。有時即使由于檢查時間較長，未能及時據(jù)導(dǎo)本批生產(chǎn)，但對于找出造成染菌事故的環(huán)節(jié)，分析染菌原因，杜絕染菌漏洞也是不可缺少的。由于生產(chǎn)菌種相產(chǎn)品的不同，檢查的時間也不完全一樣：但總的原則是一致的，即每個工序或經(jīng)一定時間都應(yīng)進行取樣檢查。檢查的一般時間或工序見下表。發(fā)酵過程的雜菌檢查 除了以上的方法外，在實際生產(chǎn)中還可以根據(jù)pH值、尾氣中CO2含量和溶解氧等參數(shù)的異常變化來判斷是否染菌。第三節(jié)發(fā)酵染菌率和染菌原因的分析發(fā)酵染菌能給生成帶來嚴(yán)重危害，防止雜菌污染是任何發(fā)酵工廠的一項重要工作內(nèi)容。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。發(fā)酵設(shè)備、空氣除菌系統(tǒng)和培養(yǎng)基滅菌系統(tǒng)等的有關(guān)設(shè)備以及管道的配置都必須嚴(yán)格符合無菌要求。如果設(shè)備結(jié)構(gòu)和管道配置不合理，制造、安裝不注意或在發(fā)酵過程中操作不慎就會使發(fā)酵液污染雜菌，導(dǎo)致產(chǎn)量下降甚至得不到產(chǎn)品。在發(fā)酵前期或中期染菌，雜菌會很快消耗掉營養(yǎng)物質(zhì)，使生產(chǎn)菌無法正常生長而引起倒罐。在發(fā)酵后期染菌，雖然沒有早期或中期染菌的影響大，一般會使產(chǎn)率下降并影響產(chǎn)物的提取，但如核苷酸等某些產(chǎn)品的發(fā)酵即使在后期染菌，也會使發(fā)酵產(chǎn)物被所染雜菌迅速消耗掉而得不到產(chǎn)品。因此，染菌問題是影響產(chǎn)率和后工序操作的主要因素之一，必須予以重視。認為染菌是不可避免的，這是一種錯誤看法?！皼Q定的因素是人不是物”。只要我們思想上重視，對各個因素和環(huán)節(jié)周密考慮、嚴(yán)格掌握，是完全可以避免和減少污染的。 本節(jié)將根據(jù)以往工廠中發(fā)生染菌事故的經(jīng)驗教訓(xùn)來分析發(fā)酵系統(tǒng)中染菌的原因，來認識整個發(fā)酵過程中可能造成污染的各種途徑并提出相應(yīng)的防治措施。由于發(fā)酵生產(chǎn)的連貫性強，在整個生產(chǎn)過程中各個環(huán)節(jié)的污染問題都不能忽視，所以本章除了著重討論發(fā)酵設(shè)備方面的污染防止問題外，對于培養(yǎng)種子設(shè)備的要求和有關(guān)操作方法也作一般介紹。一、發(fā)酵染菌率1，總?cè)揪剩褐敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批次與總投料批次數(shù)之比乘以100得到的百分率。2，設(shè)備染菌率：統(tǒng)計發(fā)酵罐或其他設(shè)備的染菌率，有利于查找因設(shè)備缺陷而造成的染菌原因。3，不同品種發(fā)酵的染菌率：統(tǒng)計不同品種發(fā)酵的染菌率，有助于查找不同品種發(fā)酵染菌的原因。4，不同發(fā)酵階段的染菌率：將整個發(fā)酵周期分成前期、中期和后期三個階段，分別統(tǒng)計其染菌率。有助于查找染菌的原因。5，季節(jié)染菌率：統(tǒng)計不同季節(jié)的染菌率，可以采取相應(yīng)的措施制服染菌。6，操作染菌率：統(tǒng)計操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的滅菌操作技術(shù)水平。二、染菌原因的分析避免在發(fā)酵生產(chǎn)中污染雜菌應(yīng)以預(yù)防為主?！胺乐赜谥巍?，事前防止勝于事后挽救。 如果一旦發(fā)生染菌現(xiàn)象就要盡快找出原因及時糾正、堵塞漏洞才能減少損失，并從中吸取經(jīng)驗教訓(xùn)，避免以后有類似情況發(fā)生，保持生產(chǎn)的正常進行。但在發(fā)酵生產(chǎn)中，往往因為生產(chǎn)過程的環(huán)節(jié)很多，同時各工廠的生產(chǎn)設(shè)備、產(chǎn)品種類和管理措施不盡相同，引起染菌的原因比較復(fù)雜，有時不能及時找出而耽誤了生產(chǎn)。如果原因一經(jīng)查出，解決的辦法還是比較容易和迅速的。所以，我們必須善于透過現(xiàn)象看本質(zhì)，對染菌的情況作具體分析，不致盲目尋找而耽誤了時間，也不致于將染菌的真正原因遺漏而造成連續(xù)染菌事故。下面根據(jù)發(fā)酵工廠的生產(chǎn)經(jīng)驗，從一般染菌的現(xiàn)象來分析引起染菌的可能原因。1，國外一抗生素發(fā)酵染菌原因的分析染菌原因百分率（%）染菌原因百分率（%）種子帶菌 接種時罐壓跌零 培養(yǎng)基滅菌不透 空氣系統(tǒng)帶菌 攪拌軸密封泄漏 泡沫冒頂 夾套穿孔 蛇管穿孔 接種管穿孔 閥門泄漏 罐蓋漏 其他設(shè)備漏 操作問題 原因不明 2，國內(nèi)一制藥廠發(fā)酵染菌原因的分析染菌原因百分率（%）外界帶入雜菌（取樣、補料帶入）設(shè)備穿孔空氣系統(tǒng)帶菌停電罐壓跌零接種蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足管理問題操作違反規(guī)程種子帶菌原因不明上述資料是國內(nèi)外抗菌素生產(chǎn)中統(tǒng)計了多年生產(chǎn)中發(fā)生染菌現(xiàn)象的各種原因所占的百分比，今列出以供參考。從發(fā)酵工廠的生產(chǎn)經(jīng)驗來看，染菌原因是以設(shè)備滲漏和空氣系統(tǒng)的染菌為主，其他則次之。3，從染菌的規(guī)模來分析染菌原因 （1）大批發(fā)酵罐染菌整個工廠中各個產(chǎn)品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)染菌現(xiàn)象而且染的是同一種菌，一般來說，這種情況是由使用的統(tǒng)一空氣系統(tǒng)中空氣過濾器失效或效率下降使帶菌的空氣進入發(fā)酵罐而造成的。大批發(fā)酵罐染菌的現(xiàn)象較少但危害極大。所以對于空氣系統(tǒng)必須定期經(jīng)常檢查。 （2）分發(fā)酵罐(或罐組)染菌 生產(chǎn)同一產(chǎn)品的幾個發(fā)酵罐都發(fā)生染菌，這種染菌如果出現(xiàn)在發(fā)酵前期可能是種子帶雜菌，如果發(fā)生在中后期則可能是中間補料系統(tǒng)或油管路系統(tǒng)發(fā)生問題所造成的。通常同一產(chǎn)品的幾個發(fā)酵罐其補料系統(tǒng)往往是共用的，倘若補料滅菌不徹底或管路滲漏，就有可能造成這些罐同時發(fā)生染菌現(xiàn)象。另外，采用培養(yǎng)基連續(xù)滅菌系統(tǒng)時，那些用連續(xù)滅菌進料的發(fā)酵罐都出現(xiàn)染菌，可能是連消系統(tǒng)滅菌不徹底所造成的。 （3）個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌和偶然染菌個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌大多是由設(shè)備問題造成的，如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損，特別是冷卻管的不易覺察的穿孔等。設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時間向前推移的現(xiàn)象，即第二批的染菌時間比第一批提早，第三批又比第二批提早。至于個別發(fā)酵罐的偶然染菌其原因比較復(fù)雜，因為各種染菌途徑都可能引起。4，從染菌的時間來分析發(fā)酵早期染菌，一般認為除了種子帶菌外，還有培養(yǎng)液滅菌或設(shè)備滅菌不徹底所致，而中、后期染菌則與這些原因的關(guān)系較少，而與中間補料、設(shè)備滲漏以及操作不合理等有關(guān)。5，從染菌的類型來分析所染雜菌的類型也是判斷染菌原因的重要依據(jù)之一。 一般認為，污染耐熱性芽抱桿菌多數(shù)是由于設(shè)備存在死角或培養(yǎng)液滅菌不徹底所致。污染球菌、酵母等可能是從蒸汽的冷凝水或空氣中帶來的。在檢查時如平板上出現(xiàn)的是淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌)，由于這種菌主要生存在水中，所以發(fā)酵罐的冷卻管或夾套滲漏所引起的可能性較大。污染霉菌大多是滅菌不徹底或無菌操作不嚴(yán)格所致。綜上所述，引起染菌的原因很多?！笆澜缟系氖虑槭菑?fù)雜的，是由各方面的因素決定的?！蔽覀儾荒軝C械地認為某種染菌現(xiàn)象必然是從某一途徑引起的，應(yīng)該把染菌的位置、時間和雜菌的類型等各種現(xiàn)象加以綜合分析，才能正確判斷從而采取相應(yīng)的對策和措施。第四節(jié)發(fā)酵染菌的防止一、種子帶菌的原因及防止1，帶菌的原因（1）無菌室的無菌條件不符合要求；（2）培養(yǎng)基滅菌不徹底；（3）操作不當(dāng)。2，種子帶菌的防止種子帶雜菌是發(fā)酵前期染菌的原因之一。在每次接種后應(yīng)留取少量的種子懸浮液進行平板、肉湯培養(yǎng)，借以說明是否是種子中帶雜菌。種子培養(yǎng)的設(shè)備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機等。（1）無菌室接種、移種等無菌操作需要在無菌室內(nèi)進行。無菌室面積不宜過大，一般約4~。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1~3個套間(緩沖過道)(參照下圖)。無菌室內(nèi)部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形，便于揩擦清洗以減少空氣中微生物的潛伏場所，室內(nèi)布置應(yīng)盡量簡單，最好能安裝空氣調(diào)節(jié)裝置，通入無菌空氣并調(diào)節(jié)室內(nèi)的溫濕度。無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。通常用30瓦紫外線滅菌燈照射20~30分鐘即可。紫外線殺菌的效率還與室內(nèi)空氣的性質(zhì)有關(guān)；空氣溫度高殺菌效率高，空氣中灰塵多殺調(diào)效率低，而相對濕度高則紫外線燈的使用壽命長。紫外線能穿過石英但不能透過玻璃。無菌室的立視圖配合使用的化學(xué)滅菌藥劑有：用作噴灑或揩擦的(以揩擦為主)有75%酒精、%新潔而滅(季胺鹽)、~1%漂白粉、%石炭酸、%過氧乙酸、1%煤酚皂(來蘇爾)、%高錳酸鉀、300單位/毫升土霉素、50單位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空間約用10毫升)或硫磺(每立方米空間約用2~3克)。要根據(jù)不同情況采用不同的滅菌劑。如檢查出無菌室中潛伏的微生物中細菌較多，用石炭酸、土霉素等滅菌較好；如無菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌體則用甲醛、雙氧水或高錳酸鉀等較好。 無菌室內(nèi)無菌度的要求是：把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內(nèi)放置30分鐘，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗，長出的菌落在3個以下為好。 在種子的無菌條件不要求很高的情況下，可以不采用無菌室而直接用無菌箱進行操作，但無菌要求很高的情況下，即使在無菌室內(nèi)還要用無菌箱操作。無菌室的利用次數(shù)要恰當(dāng)，每次使用時間也不宜過長。用具要經(jīng)蒸汽滅菌或用滅菌劑揩擦后才能帶入使用。（2）滅菌鍋 滅菌鍋是一種壓力容器，作為培養(yǎng)種子及小型試驗用具的滅菌之用，有立式和臥式兩種。滅菌操作時需要注意排氣管是否暢通，因為滅菌鍋的排氣管較小，易被鐵銹或瓶子破碎后的培養(yǎng)基等所堵塞。如果排氣管不道，鍋內(nèi)空氣排不出去形成氣團，蒸汽就不易滲入，從而使滅菌不徹底。用某種較耐熱的芽抱桿菌進行試驗證明：在排氣不通暢的情況下，以1公斤/厘米2的蒸汽壓力經(jīng)30分鐘滅菌后進行檢查，發(fā)現(xiàn)某些部位的三角瓶中，滅菌前放入的芽抱桿菌沒有被殺死。如果不是采用蒸汽而是用鍋內(nèi)燒水的辦法進行滅菌，那末排氣的時間更要長一些，不然水蒸汽來不及驅(qū)出空氣而使被滅菌的瓶中的冷空氣排不盡。 通入蒸汽后使瓶內(nèi)培養(yǎng)基溫度達到121186。C所需的時間與瓶內(nèi)培養(yǎng)基的體積有關(guān)，其試驗結(jié)果見下表。通入表壓為1公斤／厘米2的蒸汽時，三角瓶中培養(yǎng)基的體積與升溫時間的關(guān)系實際上，使用蒸汽的壓力一般大于1公斤/厘米2，所以上表的數(shù)據(jù)僅供對照參考，但根據(jù)上表的試驗結(jié)果可以說明培養(yǎng)基體積與升溫時間的關(guān)系。 （3）搖瓶機 搖瓶機(亦稱搖床)是培養(yǎng)好氣菌的小型試驗設(shè)備或作為種子擴大培養(yǎng)之用，常用的搖瓶機有往復(fù)式(圖72)和旋轉(zhuǎn)式(圖74)兩種。往復(fù)式搖瓶機的往復(fù)頻率一般在80~140次／分，沖程一般為6~14厘米，如頻率過快、沖程過大或瓶內(nèi)液體裝料過多，在搖動時