【正文】 濾。 三、微生物細胞的破碎微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細胞或組織之外，例如細菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉菌產(chǎn)生的糖化酶等，稱為胞外產(chǎn)物。 （4）超聲波法細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。影響自溶過程的因素有溫度、時間、pH緩沖液濃度、細胞代謝途徑等。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問題。3，鹽析法的優(yōu)點成本低，不需要什么特別昂貴的設(shè)備；操作簡單，安全；對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。7，鹽濃度的表示法鹽析法中的鹽濃度通常以鹽溶液的飽和度表示，飽和的溶液成為100%飽和度。 幾種蛋白質(zhì)在不同離子強度下的鹽析效應(yīng)見上圖，從圖中可以看出，當硫酸按飽和度達到20%時，纖維蛋白原首先析出，飽和度增至28—33%時，血紅蛋白析出，飽和度再增至33—35%時，擬球蛋白析出，飽和度至50%以上，清蛋白析出，飽和度最后達到80%時，肌紅蛋白析出。下圖所示是幾種不同電解質(zhì)下，一氧化碳血紅蛋白溶解度曲線。下圖是在不同pH的濃磷酸鹽緩沖液下血紅蛋白的溶解度曲線。許多蛋白質(zhì)在高離子強度溶液中25C時的溶解度比4C時溶解度明顯地減少。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。 6，有機溶劑沉淀的影響因素影響有機溶劑沉淀的因素有：溫度、蛋白的濃度、pH、金屬離子、離子強度。7，有機溶劑沉淀應(yīng)注意的問題（1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質(zhì)的變性。（9）少量中性鹽的存在能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機溶劑水溶液的溶解度。一、吸附法的原理吸附法是利用吸附劑與雜質(zhì)、色素物質(zhì)、有毒物質(zhì)、產(chǎn)品之間分子引力的差異，從而起到分離的作用。2，化學(xué)吸附化學(xué)吸附是由于吸附劑在吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的，屬于庫侖力 范圍。一般要求吸附容量大，吸附速度快和機械強度好。（3）極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。這里溶液稱流動相，而固體稱固定相。二、離子交換劑的分類1，陽離子交換劑：磺酸(SO3H)、磷酸(PO3H2)、 羧酸（COOH）和酚羥基（OH）。 膜分離技術(shù)的優(yōu)點1，適用范圍廣； 2，膜分離過程為物理過程，不需加入化學(xué)藥劑； 3，膜分離技術(shù)分離裝置簡單，占地面積小，系統(tǒng)集成容易 ；4，膜分離過程系統(tǒng)簡單、操作容易，且易控制，便于維修，有利于生產(chǎn)自動化的推廣與普及。吸附在離子交換劑上的物質(zhì)可以通過改變pH使吸附的物質(zhì)失去電荷而達到解離但更多的是通過增加離子強度，使加入的離子與被吸附物質(zhì)競爭離子交換劑上的電荷位置，使被吸附物質(zhì)與離子交換劑解開。一般說來，對混合物的吸附較純物質(zhì)的吸附為差。2，吸附物的性質(zhì)有下列一些規(guī)則可用來預(yù)測吸附的相對量。六、吸附劑的種類1，疏水或非極性吸附劑（活性炭）2，親水或極性吸附劑（硅膠、氧化鋁）3，離子交換樹脂吸附劑七、 影響吸附過程的因素1，吸附劑的性質(zhì) 吸附劑的理化性質(zhì)對吸附的影響很大。由于凝膠類吸附劑、大網(wǎng)格聚合物吸附劑的應(yīng)用，克服了以上缺點，近年吸附法又得到重視。第四節(jié) 吸附法在發(fā)酵工業(yè)的下游加工過程中，吸附法應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)品的除雜、脫色、有毒物質(zhì)和抗生素的提純精制。（7）接近等電點時，以引起沉淀所需加入有機溶劑的量較少。適宜的pH值可大大提高分離的分辨能力（4）金屬離子對有機溶劑沉淀的影響一些多價離子如Zn2 +和Ca 2+在一定的pH值下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的活性。這個順序還受溫度、pH、鹽離子濃度的影響。二、有機溶劑沉淀1，原理有機溶劑的沉淀作用主要是降低水溶液的介電常數(shù)，溶液的介電常數(shù)減少就意味著溶質(zhì)分子異性電荷庫侖引力的增加從而使溶解度減少。但對于蛋白質(zhì)、酶等生物大分子在高離子強度溶液中，溫度的升高，它們的溶解度有時不但不升高。10，pH對鹽析的影響一般地說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大；如果所帶的電荷減少至接近于零時溶解度最少，我們稱此時的pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(PI)。離子強度的大小對蛋白質(zhì)的溶解度起著決定性的影響。一般來說離子強度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。廢水處理容易。一、鹽析法1，鹽析的定義在蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽使其沉淀析出的過程。（10）化學(xué)法用酸堿及表面活性劑處理，可以使蛋白質(zhì)水解，細胞溶解或使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細胞壁上糖蛋白分子的α1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。 （3）離心分離 ①優(yōu)點：②分離速度快，效率高； ③操作時衛(wèi)生條件好等優(yōu)點； ④適合于大規(guī)模的分離過程。其優(yōu)缺點概括如下：優(yōu)點：①板框壓濾機的過濾面積大；②過濾推動力(壓力差)能較大幅度地進行調(diào)整，并能耐受較高的壓力差；③結(jié)構(gòu)簡單，價格低；④動力消耗少等優(yōu)點。例如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，加入淀粉酶后，能使過濾速度加快。（2）填充凝固劑 改善過濾性能較好的方法是加入一些反應(yīng)劑，它們能相互作用，或和某些溶解性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4等)。在菌體絲自溶前必須放罐，因為細胞自治后的 分解產(chǎn)物一股很難過濾。（1）菌種對過濾速度影響真菌的菌絲比較粗大，如青霉菌的菌絲直徑可達10236。適宜的加量通常由實驗得出，雖然高分子絮凝劑分子量提高，鏈增長，可使架橋效果明顯，但是，分子量不能超過一定的限度，因為隨分子量提高，高分子絮凝 劑的水溶性降低，因此分子量的選擇應(yīng)適當溶液pH的變化常會影響離子型絮凝劑中功能團的電離度，從而影響分子鏈的伸展形態(tài)。（1）機理電解質(zhì)將膠體粒子表面上的電荷中和，減少存在于膠體粒子間的靜電斥力，使倫敦如四環(huán)類抗生素廢液中，加入硫酸鉛，在60℃下反應(yīng)生成草酸鉛。 3，選擇下游加工工藝的原則：（1）是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物 （2）原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度 （3）產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異 （4）產(chǎn)品用途和質(zhì)量標準 （5）產(chǎn)品的市場價格 （6）廢液的處理方法等 第二節(jié) 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離的目的：分離菌體和其他懸浮顆粒(細胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物)；除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液性質(zhì)，以利于提取和精制的順利進行。三、分離過程的機理與分離操作1，物理性質(zhì)（1）力學(xué)性質(zhì)：重力、離心力、篩分；（2）熱力學(xué)性質(zhì)：狀態(tài)變化、相平衡；（3）傳質(zhì)性質(zhì)：粘度、擴散、熱擴散；（4）電磁性質(zhì)：電泳、電滲析、磁化；2，化學(xué)性質(zhì)（1）化學(xué)熱力學(xué)；化學(xué)平衡；（2）反應(yīng)動力學(xué)：反應(yīng)速率；（3）光化學(xué)性質(zhì)：激光激發(fā)、離子化；3，生物學(xué)性質(zhì)（1）分子識別：生物親和作用、生物學(xué)識別；（2）輸送性質(zhì)：生物膜輸送；（3）反應(yīng)、響應(yīng)、控制：酶反應(yīng)、免疫系統(tǒng)。它由一些化學(xué)工程的單幾操作組成，但由于生物物質(zhì)的特性，有其特殊要求，而且其中某些單元操作一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較少。2)輪換使用專一性不同的菌株。設(shè)備的滲漏、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底都可能是噬菌體感染的途徑。還有將種子罐中種子培養(yǎng)好后，進行冷凍保壓(，10℃左右)，經(jīng)平板檢查證明無雜菌后，再接入發(fā)酵罐發(fā)酵，這一措施在一些谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工廠取得很好效果。 如果種子培養(yǎng)或種子罐中發(fā)現(xiàn)污染，則這批種子就不能再繼續(xù)擴大培養(yǎng)，因為此時的損失畢竟是很小的。3，其他操作問題實罐滅菌時，當經(jīng)過加熱和維持時間后開始冷卻，此時可能因蒸汽冷凝而使罐壓突然降低甚至?xí)纬烧婵?，所以此時必須將無菌空氣通入罐內(nèi)保持一定壓力，并注意壓力變化，隨時進行調(diào)節(jié)。 為了加快加熱時間，凡能進蒸汽的管路在滅菌時都可同時進汽，但各管路的阻力不同，大量蒸汽從阻力小的進汽管中沖入罐內(nèi)，這是一種蒸汽短路現(xiàn)象，使物料受熱不勻，部分培養(yǎng)液過熱而部分培養(yǎng)液則可能滅菌不透，尤其是罐底的空氣分布管是主要的進汽口，但由于液柱壓力較大，阻力就比其他進口大，所以在滅菌操作時應(yīng)將空氣分布管的進口閥門開得比其他進氣口的閥門大一些，以保證有足夠的蒸汽從空氣分布管進入，促使培養(yǎng)液激烈翻動起攪拌混和作用。如為冷凝水將使介質(zhì)受潮，如為發(fā)酵液則過濾介質(zhì)被浸透結(jié)成硬塊使過濾器失效。排出蒸汽均勻并呈青色有力表示情況良好，排出蒸汽呈霧狀無力表明壓得太緊，而當排出蒸汽斷續(xù)不均勻以及進出口兩測的壓力降過小時則就有可能是過濾層有位移現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)不正常的情況應(yīng)立即予以糾正。同時，在過濾介質(zhì)用蒸汽滅菌時，太緊則蒸汽穿透力差，穿透力差滅菌效果也差。如圖713a所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以應(yīng)在閥2的半截上裝設(shè)旁通，焊上一個小的放氣閥，如圖713b所示，此段管路即可得到蒸汽的充分滅菌。發(fā)生這種事故后，如襯里鋼板尚未破裂可用罐內(nèi)加水壓的方法將其恢復(fù)原狀(水的壓力不應(yīng)超過設(shè)備的允許使用壓力)，應(yīng)盡可能避免錘擊，用錘擊的方法使鋼板受力不勻易造成破損。 發(fā)酵罐中除了上述容易造成死角的地區(qū)外，其他還有一些容易造成死角的地區(qū)，如擋板(或冷卻列管)與罐身固定的支撐板周圍和不能在滅菌時排氣的百腸管，溫度計接頭等，對于這些地區(qū)每次放罐后的清洗工作應(yīng)注意，經(jīng)常檢查。例如法蘭與管子焊接時受熱不勻使法蘭翹曲密封面發(fā)生凹凸不平現(xiàn)象就會造成死角(圖78c)。如有自控和測量儀表，那末還應(yīng)包括這些儀表所需的有關(guān)管路(圖中末包括)。但需經(jīng)常拆卸的管路則不宜用焊接連接。(1)螺紋連接螺紋連接需在管端鉸出管螺紋，安裝時在螺紋上涂以白漆并加麻絲(也有用聚四氟乙烯薄膜)作為填料，如密封要求高的可用石墨粉加少許機油作為填料，或用氧化鉛甘油膠合劑更好。閥體內(nèi)裝有橡皮隔膜，用螺釘與閥芯連接，當閥桿作上下運動時就帶動隔膜上升或下降。平面形緊密面的墊料采用橡膠或聚四氟乙烯，關(guān)閉后墊料與閥座緊緊地吻合，達到不漏的目的。 （二）管件的滲漏 與發(fā)酵罐相連接的管路很多，有空氣、蒸汽、水、物料、排氣、排污等管路，管路多，相應(yīng)的管件和閥門也多。氣壓法是先在發(fā)酵罐內(nèi)放滿清水，用壓縮空氣通入管子，觀察水面有無氣泡產(chǎn)生以確定管子有否滲漏和滲漏的部位。冷卻水的壓力通常大于罐壓，如果有微孔，冷卻水就會進入發(fā)酵液而引起染菌。所以搖瓶機將成為放大發(fā)酵試驗過程中的一種更有效的工具。但懸掛式搖瓶機如為多層時，每層的沖程不一樣，越是上層沖程越小。放在搖瓶機上培養(yǎng)瓶中發(fā)酵液所需的氧是由室內(nèi)空氣經(jīng)瓶口包扎的紗布(一般是八層)或棉塞通入的，所以氧的傳遞與瓶口的大小，瓶口的幾何形狀和棉塞或紗布層的厚度和密度有關(guān)。用某種較耐熱的芽抱桿菌進行試驗證明：在排氣不通暢的情況下，以1公斤/厘米2的蒸汽壓力經(jīng)30分鐘滅菌后進行檢查，發(fā)現(xiàn)某些部位的三角瓶中，滅菌前放入的芽抱桿菌沒有被殺死。如檢查出無菌室中潛伏的微生物中細菌較多，用石炭酸、土霉素等滅菌較好；如無菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌體則用甲醛、雙氧水或高錳酸鉀等較好。為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有1~3個套間(緩沖過道)(參照下圖)。“世界上的事情是復(fù)雜的，是由各方面的因素決定的。至于個別發(fā)酵罐的偶然染菌其原因比較復(fù)雜，因為各種染菌途徑都可能引起。3，從染菌的規(guī)模來分析染菌原因 （1）大批發(fā)酵罐染菌整個工廠中各個產(chǎn)品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)染菌現(xiàn)象而且染的是同一種菌，一般來說，這種情況是由使用的統(tǒng)一空氣系統(tǒng)中空氣過濾器失效或效率下降使帶菌的空氣進入發(fā)酵罐而造成的?！胺乐赜谥巍?，事前防止勝于事后挽救。一、發(fā)酵染菌率1，總?cè)揪剩褐敢荒陜?nèi)發(fā)酵染菌的批次與總投料批次數(shù)之比乘以100得到的百分率。在發(fā)酵前期或中期染菌，雜菌會很快消耗掉營養(yǎng)物質(zhì)，使生產(chǎn)菌無法正常生長而引起倒罐。有時即使由于檢查時間較長，未能及時據(jù)導(dǎo)本批生產(chǎn)，但對于找出造成染菌事故的環(huán)節(jié)，分析染菌原因，杜絕染菌漏洞也是不可缺少的。七，發(fā)酵染菌的危害1，直接經(jīng)濟損失2，間接經(jīng)濟損失第二節(jié) 發(fā)酵過程中染菌的檢查判斷一，雜菌的檢查方法 借助適當?shù)姆椒?，才能正確而及時地發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過過程是否污染雜菌和染菌的原因與途徑。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。六，染菌對三廢處理的影響使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費用和時間?？茖W(xué)合理的選擇檢查工序和時間，對于除去已污染雜菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有著直接的指導(dǎo)意義。如果設(shè)備結(jié)構(gòu)和管道配置不合理，制造、安裝不注意或在發(fā)酵過程中操作不慎就會使發(fā)酵液污染雜菌，導(dǎo)致產(chǎn)量下降甚至得不到產(chǎn)品。由于發(fā)酵生產(chǎn)的連貫性強，在整個生產(chǎn)過程中各個環(huán)節(jié)的污染問題都不能忽視，所以本章除了著重討論發(fā)酵設(shè)備方面的污染防止問題外，對于培養(yǎng)種子設(shè)備的要求和有關(guān)操作方法也作一般介紹。二、染菌原因的分析避免在發(fā)酵生產(chǎn)中污染雜菌應(yīng)以預(yù)防為主。從發(fā)酵工廠的生產(chǎn)經(jīng)驗來看，染菌原因是以設(shè)備滲漏和空氣系統(tǒng)的染菌為主，其他則次之。設(shè)備的腐蝕磨損所引起的染菌會出現(xiàn)每批發(fā)酵的染菌時間向前推移的現(xiàn)象，即第二批的染菌時間比第一批提早，第三批又比第二批提早。綜上所述，引起染菌的原因很多。無菌室面積不宜過大，一般約4~。要根據(jù)不同情況采用不同的滅菌劑。如果排氣管不道，鍋內(nèi)空氣排不出去形成氣團，蒸汽就不易滲入，從而使滅菌不徹底。旋轉(zhuǎn)式搖瓶機的偏心距一般在3~6厘米之間，旋轉(zhuǎn)次數(shù)為60~300轉(zhuǎn)／分。 滾輪式搖瓶機是將搖床置于四個滾輪上，懸掛式搖瓶機(圖73)是用四條吊桿將搖床吊在