【正文】 件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 23 水解片段 用木瓜蛋白酶 可將 IgG抗體分子水解成大小相近的 三個(gè) 片段 （ 2 Fab、 Fc片段 ) 。 其中有兩個(gè)相同的片段 ， 可與抗原特異性結(jié)合 ， 稱為 抗原結(jié)合片段 （ Fab） ；另一個(gè)片段可形成蛋白結(jié)晶 ， 稱為 Fc片段 (Fc) 。 IgG抗體分子可被 胃蛋白酶 消化成兩個(gè)大小不同的片段 ， 一個(gè)是具有雙價(jià)抗體活性F(ab’)2片段 ， 小片段類似于 Fc， 稱為 pFc’片段 ， 后者無任何生物學(xué)活性 。 Fab片段的生物學(xué)活性 抗體結(jié)合抗原的活性由Fab所呈現(xiàn) ， 由 VH和 VL所組成的抗原結(jié)合部位 ，可結(jié)合抗原 ， 是 決定抗體分子特異性的部位 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 24 Fc片段的生物學(xué)活性 該片段無結(jié)合抗原活性 ， 但與抗體分子的生物學(xué)活性有密切關(guān)系 ： 過胎盤； ； Ig分子的親細(xì)胞性 (即與帶 Fc受體細(xì)胞的結(jié)合 )； 外分泌液等都是 Fc片段的功能 。 補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn) 位于 CH2上； Fc受體結(jié)合位點(diǎn) 在 CH3上 。 Ig抗原特異性 Fc片段是 Ig分子中的重鏈穩(wěn)定區(qū) ， 因此它是決定各類 Ig抗原特異性 的部位 。 用 Ig免疫異種動(dòng)物產(chǎn)生的抗抗體 (第二抗體 )， 可與相應(yīng) Ig發(fā)生抗原抗體反應(yīng) 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 25 4. Ig的特殊分子結(jié)構(gòu) 某些 Ig還具有一些特殊分子結(jié)構(gòu) ，如 連接鏈 、分泌成分 、糖類 等為個(gè)別 Ig所具有 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 26 連接鏈 又稱 J 鏈 ， 在 Ig中 ， IgM是五聚體 ， 分泌型的 IgA是二聚體 ， 這些單體之間就是依靠 J 鏈 連接起來的 。 J 鏈?zhǔn)且粭l多肽鏈 ， 內(nèi)含 10％ 糖成分 。 分泌成分 (SC) 又稱 分泌片 ， 是分泌型 IgA所特有的一種特殊結(jié)構(gòu) ， 為 多肽鏈 (含 6％ 糖成分 )。 它是由局部粘膜的上皮細(xì)胞所合成的 ， 在 IgA通過粘膜上皮細(xì)胞的過程中SC與之結(jié)合形成分泌型的二聚體 。 SC可防止 IgA在消化道內(nèi)為蛋白酶所降解 ， 從而使 IgA能發(fā)揮免疫作用 。 糖類 Ig是含糖量相當(dāng)高的蛋白 ， 特別是 IgM和 IgA。糖類在 Ig的分泌過程中起著重要作用 ， 并可使 Ig分子易溶 和具有 防止其分解 的作用 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 27 三 、 Ig的種類與抗原性 1. 種類 Ig可分為類 、 亞類 、 型 、亞型及亞群等 。 分類分型 Ig類的區(qū)分是依據(jù)其重鏈 C區(qū)的理化特性及抗原性 的差異 ， Ig可分為IgG、 IgM、 IgA、IgE和 IgD 5大類及其亞型 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 28 2. Ig的抗原性 Ig是蛋白質(zhì) ， 因此一種動(dòng)物的 Ig對另一種動(dòng)物而言是良好的抗原 。 同種型 指在 同一種動(dòng)物所有個(gè)體的不同類型的 Ig共同具有的抗原特異性 ， 同種間不表現(xiàn)出抗原性 ，只是在異種動(dòng)物之間才表現(xiàn)出抗原性 。 Ig的同種型抗原 決定簇主要存在于重鏈 C區(qū) 。 同種異型 指 Ig在 同一種動(dòng)物不同個(gè)體之間呈現(xiàn)出的抗原性 。 同種異型的抗原決定簇存在于 IgG、 IgA、IgE的重鏈 C區(qū)和 k型輕鏈的 C區(qū) 。 同種異型是 Ig穩(wěn)定的遺傳標(biāo)志 ， 可用于親子鑒定 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 29 獨(dú)特型 抗體分子的特異性 是由 Ig的重鏈和輕鏈可變區(qū)所決定 的 ， 因此體內(nèi)針對不同抗原分子的抗體之間的差別表現(xiàn)在 Ig分子的可變區(qū) ， 這種差別就決定了抗體分子在機(jī)體內(nèi)具有抗原性 ， 由 抗體分子的可變區(qū)呈現(xiàn)的抗原性就稱為 Ig的獨(dú)特型 。 獨(dú)特位 獨(dú)特型由 Ig可變區(qū)若干個(gè)抗原決定簇所組成 ， 它們被稱為 獨(dú)特位 。 獨(dú)特型在異種 、 同種異體乃至同一個(gè)體內(nèi)均可刺激產(chǎn)生相應(yīng)的抗體 ，稱為 抗獨(dú)特型抗體 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 30 四 、 各類 Ig的主要特性與功能 1. IgG 是人和動(dòng)物 血清中含量最高 的 Ig (表 84102)， 占血清 Ig總量的 75％ 80％ 。 IgG是介導(dǎo)體液免疫的 主要抗體 ， 多以單體形式存在 。 產(chǎn)生與分布 IgG主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生 ， 主要在 血漿 中 （ 占 75％ 80％ ） ， 其余存在于組織液 和 淋巴液 中 。 IgG是 惟一可通過人 (和兔 )胎盤的抗體 ， 在新生兒的抗感染中起重要作用 。 IgG的功能 IgG可發(fā)揮 抗菌 、 抗病毒 、 抗毒素以及抗腫瘤 等免疫學(xué)活性 ， 能 調(diào)理 、 凝集和沉淀 抗原 ，與抗原結(jié)合后 能結(jié)合補(bǔ)體 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 31 2. lgM 是動(dòng)物機(jī)體 初次體液免疫應(yīng)答最早產(chǎn)生的 Ig， IgM是 由五個(gè)單體組成的五聚體 ， 是所有 Ig中 分子量最大 的 。 產(chǎn)生與分布 IgM主要由脾臟和淋巴結(jié)中 B細(xì)胞產(chǎn)生 ， 只分布于 血液 中 ， 僅占血清 lg的 10％ 左右 。IgM在體內(nèi)產(chǎn)生最早 ， 在抗感染免疫的早期起著十分重要的作用 。 IgM的功能 早期抗感染免疫 ， 具有 抗菌 、 抗病毒 、 中和毒素 等免疫活性 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 32 3. IgA 以 單體和二聚體 兩種分子形式存在 。 單體存在于血清中 ， 稱為 血清型 IgA， 約占血清 Ig的 10％20％ ； 二聚體為分泌型 IgA。 產(chǎn)生與分布 分泌型 IgA是由 粘膜固有層中的漿細(xì)胞 所產(chǎn)生 。 主要存在于各種分泌液中 。 分泌型 IgA對機(jī)體呼吸道 、 消化道等 局部粘膜免疫 起著相當(dāng)重要的作用 ， 可抵御經(jīng)粘膜感染的病原微生物 。 在傳染病預(yù)防中 ， 經(jīng) 滴鼻 、 點(diǎn)眼 、 飲水及噴霧 途徑免疫 ， 均可產(chǎn)生分泌型 IgA而建立相應(yīng)的粘膜免疫力 。 IgA功能 具有 抗菌 、 抗病毒 、 中和毒素 等免疫活性 ， 雙體 IgA具有重要的 局部粘膜免疫功能 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 33 IgE的產(chǎn)生部位與分泌型 IgA相似 ， 在血清中的含量甚微 。 IgE是一種親細(xì)胞性抗體 ， 易與皮膚組織 、 肥大細(xì)胞 、 血液中的嗜堿性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合 ， 可 介導(dǎo) I型過敏反應(yīng) 。 IgE在抗寄生蟲 、 某些真菌感染方面也有重要作用 。 很少分泌 ， 在血清中的含量極低 ， 而且不穩(wěn)定 ， 容易降解 。 IgD分子量為 1720萬 。 IgD主要作為 成熟 B細(xì)胞膜上的抗原特異性受體 ， 是 B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志 。 此外 IgD與免疫記憶與某些過敏反應(yīng)有關(guān) 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 34 五 、 抗體的制備 （ 一 ） 人工制備抗體的種類 1. 多克隆抗體 (PcAb) 采用傳統(tǒng)的免疫方法 ， 將抗原物質(zhì)經(jīng)不同途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi) ， 經(jīng)免疫后 ， 分離出血清 ， 由此獲得的抗血清即為 多克隆抗體 。 細(xì)菌病毒抗原 ， 均是由多種抗原成分組成 ， 即使純蛋白質(zhì)抗原分子也含有 多種抗原表位 ， 因此進(jìn)入機(jī)體后可 激活許多淋巴細(xì)胞克隆 ， 機(jī)體可產(chǎn)生 針對各種抗原成分或抗原表位的抗體 ， 由此獲得的抗血清是一種多克隆的 混合抗體 ， 具有高度的 異質(zhì)性 。 一只小鼠能產(chǎn)生約 107108 種不同抗體 ， 人約 109種 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 35 2. 單克隆抗體 (McAb) 由一個(gè) B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞 (漿細(xì)胞 )產(chǎn)生的 針對單一抗原決定簇的抗體 ， 稱為單克隆抗體 。 McAb的特點(diǎn) McAb的重鏈 、 輕鏈及其 V區(qū)獨(dú)特型的特異性 、 親和力 、 生物學(xué)性狀及分子結(jié)構(gòu)均完全相同 。 McAb技術(shù)原理 用人工的方法將 產(chǎn)生特異性抗體的 B細(xì)胞與同系骨髓瘤細(xì)胞融合 ， 形成 B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞 ， 這種雜交瘤細(xì)胞 既具有骨髓瘤細(xì)胞無限繁殖特性 ， 又具有 B細(xì)胞分泌特異性抗體的能力 ，由 克隆化的 B細(xì)胞雜交瘤所產(chǎn)生的抗體即為單克隆抗體 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 36 單克隆抗體的問世 ， 極大地推動(dòng)了免疫學(xué)及其他生物科學(xué)的發(fā)展 ，并于 1984年獲得諾貝爾獎(jiǎng) 。 McAb優(yōu)點(diǎn) 與多克隆抗體比較 ， McAb具有無可比擬的優(yōu)越性 ， 具有 高特異性 、 高純度 、 均質(zhì)性好 、 親和力不變 、 重復(fù)性強(qiáng) 、 效價(jià)高 、 成本低 、并可大量生產(chǎn) 等優(yōu)點(diǎn) 。 （ 二 ） B細(xì)胞雜交瘤株建立與 McAb生產(chǎn)技術(shù) 基本過程 B細(xì)胞的制備 、 骨髓瘤細(xì)胞的制備 細(xì)胞融合 檢測抗體 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 細(xì)胞株凍存或單克隆抗體的生產(chǎn) 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 37 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 38 (1) B細(xì)胞的制各 可用提純的抗原免疫 Balb/c或其他品系小鼠 ， 免疫 23次間隔 24周 ， 最后一次免疫后 34d， 取小鼠脾臟 ， 制成 103/ml的脾細(xì)胞懸液 ，即為親本的 B細(xì)胞 。 (2) 骨髓瘤細(xì)胞的制備 用與免疫 相同品系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞 ， 要求其本身不能分泌 Ig， 而且具有某種營養(yǎng)缺陷 ， 可用 SP2/0或 NS1， 它們 缺少次黃膘吟 鳥膘吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 ， 不能在 HAT培養(yǎng)基上生長 。 (3) 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備 常用 小鼠巨噬細(xì)胞或胸腺細(xì)胞 作為飼養(yǎng)細(xì)胞 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 39 (4) 選擇培養(yǎng)基 常用 HAT選擇培養(yǎng)基 ， H為次黃嘌呤 ，T為胸腺嘧啶核苷 ， 二者都是旁路合成 DNA的原料；A是氨基喋呤 ， 是細(xì)胞內(nèi)源性合成 DNA的阻斷劑 。 在該培養(yǎng)基中 ， 末融合的骨髓瘤細(xì)胞不能生長 ， 因它不能利用旁路途徑合成 DNA， 內(nèi)源性的合成又受到氨基喋吟的阻斷； 至于未融合的脾細(xì)胞則在 2周內(nèi)自然死亡 ， 所以只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在該培養(yǎng)基中生長 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 40 (5) 細(xì)胞融合 將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按一定比例(一般 3:15:1)混合 ， 離心后棄上清液 ， 然后緩慢加入 融合劑 50％ 聚乙二醇 (PEG4000)， 搖動(dòng)試管 。 靜置 90s， 逐漸加入 HAT培養(yǎng)基 ， 分于加有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔培養(yǎng)板孔中 ， 置 5％ 10％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 。5d后更換一半 HAT培養(yǎng)基 ， 再 5d后改用 HT培養(yǎng)基 ，再經(jīng) 5d后用完全 DMEM培養(yǎng)基 。 (6) 檢測抗體 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)后 ， 應(yīng)用敏感的血清學(xué)方法檢測各孔中的抗體 。 視抗原性質(zhì)的不同 ，可采用放射免疫分析 、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 、 免疫熒光抗體技術(shù)間接法等 。 通過檢測篩選出抗體陽性孔 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 41 (7) 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 對于 抗體陽性孔 的雜交瘤細(xì)胞 ， 應(yīng) 盡早克隆化 ， 一方面是 保純： 獲得的雜交瘤細(xì)胞株是由一個(gè)細(xì)胞增殖而來的 ， 即單個(gè)克隆；另一方面 防止染色體丟失： 防雜交瘤細(xì)胞因染色體丟失而喪失分泌抗體的能力 。 一般需反復(fù)克隆35次方能使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定 。 克隆的方法包括 有限稀釋法 、 顯微操作法和軟瓊脂平板法 。 課件 002 獸醫(yī)微生物學(xué)教學(xué)課件 42 (8) 單克隆抗體的生產(chǎn) 獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞克隆后 ， 即可用于生產(chǎn)單克隆抗體 。 可采用的方法有： 可 將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔 ， 瘤細(xì)胞可在小鼠腹腔中無限繁殖 ， 導(dǎo)致腹水產(chǎn)生 ，