【正文】 吉林市地處邊疆近海省，自然環(huán)境優(yōu)越，是我國(guó)最具魅力的城市之一，是福布斯排行榜評(píng)價(jià)最適合發(fā)展工業(yè)的城市，是吉林省玉米，水稻的主要產(chǎn)區(qū)之一。但是 ，吉林市經(jīng)濟(jì)發(fā)展不平衡，缺少生物工程高新技術(shù)項(xiàng)目。引進(jìn)生物工程高新技術(shù)企業(yè)， 扶持 地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭項(xiàng)目是吉林市經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大舉措之一，因此，該項(xiàng)目成為吉林市政府和吉林高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)重點(diǎn)招商引資項(xiàng)目。 有利于資源再利用 、 發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì) 、提高資源經(jīng)濟(jì)價(jià)值 玉米及其它糧食秸稈多年以來(lái)一直作為廢棄物或燃料，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值幾乎趨于零。基因重組纖維素酶項(xiàng)目采用的主要原料是玉米秸稈。這一資源是可再生資源，經(jīng)過(guò)粗加工，每噸玉米秸稈價(jià)格可以達(dá)到600— 900 元，而制成纖維素酶，以粗加工的 秸稈為基數(shù)，每噸秸稈產(chǎn)生的價(jià)值可 提升十倍左右，提高了資源利用率，提升了資源的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 市場(chǎng)分析 該項(xiàng)目產(chǎn)品的 主要應(yīng)用領(lǐng)域 為 飼料 、麻棉 紡織 、 制 藥 、 生物發(fā)酵等行業(yè)，該項(xiàng)目產(chǎn)品是上述行業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中不可或缺的添加劑。 據(jù) 不完全 統(tǒng)計(jì) ，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)纖維素酶年需求大約 12 萬(wàn)噸以上， 05年至 06 年該類產(chǎn)品年需求增幅為 38％；國(guó)際市場(chǎng)年需求大約 40 萬(wàn) 8 噸，主要集中在歐美地區(qū)，占國(guó)際市場(chǎng)總消耗量的 70％，而且需求量正在以每年 8％的速度增長(zhǎng)。此外，除燃料酒精行業(yè)外，用戶直接使用的是復(fù)合酶，纖維素酶在復(fù)合酶中添加比例一般為 80％左右，因此，纖維素酶市場(chǎng)需求量 的統(tǒng)計(jì)一般以復(fù)合酶用量為依據(jù)。復(fù)合酶年用量統(tǒng)計(jì)如下（詳見附件）： 飼料行業(yè)： 我國(guó)年產(chǎn)飼料 1 億噸左右，按每噸飼料添加 公斤復(fù)合酶計(jì)算，年復(fù)合酶用量約為 5 萬(wàn)噸左右，其中纖維素酶添加量為 4 萬(wàn)噸左右。 麻棉紡織行業(yè)： 我國(guó)洗滌復(fù)合酶年用量 2 萬(wàn)噸左右， 其中纖維素酶添加量為 。 啤酒行業(yè)： 我國(guó)年產(chǎn)啤酒 3500萬(wàn)噸左右，需大麥或小麥 160萬(wàn)噸，按每噸添加 ，啤酒復(fù)合酶年用量 萬(wàn)噸左右，其中纖維素酶添加量為 2萬(wàn)噸左右。 燃料酒精行業(yè)： 該行業(yè)為纖維素酶潛在的巨大市 場(chǎng)。目前我國(guó)年產(chǎn)燃料酒精 160 萬(wàn)噸，預(yù)計(jì) 2020年年產(chǎn)量將達(dá)到 800— 900 萬(wàn)噸 。纖維酶是生產(chǎn)非糧燃料酒精必須使用的催化劑，按每 6噸原料生產(chǎn) 1噸燃料酒精計(jì)算，預(yù)計(jì) 2020 年，秸稈等非糧原料年用量最少 4800 萬(wàn)噸，纖維素酶投料比按每噸原料 3‰計(jì)算，年需求量將達(dá)到 14 萬(wàn)噸左右。 產(chǎn)品銷售 酶制劑生產(chǎn)廠家一般不直接面對(duì)終端用戶，只面對(duì)銷售代理商。 9 因此，我公司現(xiàn)階段只向相關(guān)代理商銷售產(chǎn)品并已簽訂了意向協(xié)議，相關(guān)情況如下： 國(guó)內(nèi)銷售： 我公司已經(jīng)和最大的銷售商夏盛集團(tuán)簽訂了意向銷售合同，夏盛集團(tuán)還出具了產(chǎn)品包 銷承諾書及該公司和用戶簽訂的銷售合同及供貨計(jì)劃。 產(chǎn)品出口： 我公司正在和 杰能科 公司、嘉吉公司進(jìn)行 接洽，公司經(jīng)營(yíng)副總曾任杰能科公司技術(shù)負(fù)責(zé)人，熟悉國(guó)外市場(chǎng)，產(chǎn)品 出口前景廣闊。 與國(guó)家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)總體思路、原則、目標(biāo)等關(guān)聯(lián)情況 該項(xiàng)目屬于生物技術(shù)類，是 國(guó)務(wù)院辦公廳《生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展“十一五”規(guī)劃》（國(guó)辦發(fā) [20xx]23號(hào)）微生物技術(shù)專項(xiàng)重點(diǎn)支持項(xiàng)目；是國(guó)家科技部科技支撐計(jì)劃 “生物技術(shù)產(chǎn)品中試與規(guī)?；a(chǎn)配套技術(shù)與工藝的研究與示范” 重點(diǎn)支持項(xiàng)目；該項(xiàng)目 20xx 年 已經(jīng)列入吉林省科技發(fā)展計(jì)劃，分別被評(píng)為重大和重 點(diǎn)項(xiàng)目并獲得省長(zhǎng)基金支持；該項(xiàng)目是地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭項(xiàng)目，是國(guó)債資金重點(diǎn)支持的項(xiàng)目。 二、項(xiàng)目技術(shù)基礎(chǔ) 項(xiàng)目成果來(lái)源及知識(shí)產(chǎn)權(quán)情況 科大公司與中國(guó)科技大學(xué)易元生物技術(shù)有限公司合作，取得了基因重組纖維素酶原始菌株構(gòu)建技術(shù)和菌株的使用權(quán)（詳見附件《專利的專有技術(shù)使用合同》）。 由科大公司提供原始菌株、菌株構(gòu)建技術(shù)及工藝方案，與吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)合作，取得了基因重組纖維素酶第二代工程菌株及菌株 10 構(gòu)建技術(shù)的所有權(quán)（詳見附件《技術(shù)合同》）。 已完成的研究開發(fā)工作及中試情況和鑒定年限 本項(xiàng)目 已完 成基因重組纖維素酶工程菌株構(gòu)建，該菌株 現(xiàn) 保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室深凍冰箱中。 20xx 年初 已經(jīng)在吉林 農(nóng)業(yè)大學(xué) 完成了中試，中試結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果一致（詳見 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室《檢測(cè)報(bào)告》 ）。 中試及小規(guī)模生產(chǎn)樣品已交付用戶 使 用，用戶已出具使用報(bào)告（詳見《 寧夏夏盛果汁果酒酶有限公司傳真函 》） 。 科大公司技術(shù)專家已經(jīng) 針對(duì)基因重組纖維素酶生產(chǎn)工藝條件 開發(fā)了 連續(xù)發(fā)酵等生產(chǎn)工藝。此外，公司技術(shù)專家有十年以上纖維素酶生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng) 掌握了成熟的纖維素酶生產(chǎn)工藝，因此，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)。 公司專家已經(jīng)設(shè)計(jì)了纖維素酶系列產(chǎn)品生產(chǎn)線，主體設(shè)備及內(nèi)部構(gòu)件和管路連接已經(jīng)完成。配套設(shè)備及 GMP 裝飾工程完工后即可投入生產(chǎn)。 必要的說(shuō)明。 纖維素酶工程菌株的構(gòu)建采用的是國(guó)際前沿的生物工程技術(shù)及基因打靶技術(shù)，但是，酶制劑生產(chǎn)工藝是公知技術(shù)。此外，生產(chǎn)過(guò)程的發(fā)酵條件優(yōu)于實(shí)驗(yàn)室條件，因此，只要中試設(shè)定條件與生產(chǎn)工藝條件一致，那么，所生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品性能將優(yōu)于中試。 技術(shù)或工藝特點(diǎn)以及與現(xiàn)有技術(shù)或工藝比較所具有的優(yōu)勢(shì) 技術(shù) 原理 纖維素酶 11 自然界中纖維素的降解需要內(nèi)切 葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作用。纖維素降解過(guò)程首先被外切纖維素酶的 CBD吸附到不溶性纖維素表面，使結(jié)晶結(jié)構(gòu)的纖維素長(zhǎng)分子鏈開裂，聚集結(jié)構(gòu)解聚，長(zhǎng)鏈分子末端部分發(fā)生游離從而為纖維素水解酶類的作用提高了可及性和反應(yīng)性，從而使纖維素易于水化；之后內(nèi)切酶作用于經(jīng)外切活化的纖維素，分解其β 1， 4 鍵，產(chǎn)生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖。在內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β 1， 4葡萄糖苷酶的協(xié)同作用下，纖維素的β 1， 4糖苷鍵逐步水解，形成纖維寡糖和葡萄糖。其催化機(jī)理與溶菌酶相似，糖苷配基的脫去涉及 2 個(gè)保守羧基氨基酸分別作為質(zhì)子供體和親核試劑執(zhí)行酸堿催化的雙置換反應(yīng)；谷氨酸位于細(xì)菌和真菌 CBH， EG 及葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)。協(xié)同作用其作用順序不是絕對(duì)按各酶的功能也不是簡(jiǎn)單固定的。 CBH 和 EG 都能引起纖維素的分散和脫纖化，因此纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被打亂導(dǎo)致變形，使纖維素酶能深入纖維素分子界面之間，從而使纖維素孔壁、腔壁和微裂隙壁的壓力增大，水分子的介入又使纖維素分子之間的氫鍵被破壞，產(chǎn)生部分可溶性的纖維的微結(jié)晶，利于進(jìn)一步降解。 基因的同源重組技術(shù) 基因的同源重組技術(shù)（ homologous rebination），又 稱基因打靶（ gene targeting），指外源 DNA與受體細(xì)胞染色體 DNA 上的同源序列之 間 發(fā)生重組并整合在預(yù)定位點(diǎn)上，從而改變細(xì)胞遺傳特性的方法。 12 根據(jù)重組后靶基因的特征可以分為兩種類型： ①由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有結(jié)構(gòu)被破壞，此即為基因破壞或剔除； ②靶基因的全部序列為新的基因所取代。這一新興技術(shù) 已 被證明為目前能精確的修飾基因組的最有效方法，從理論上講它將使人類能按設(shè)計(jì)對(duì)極其復(fù)雜的細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)、定量的改變，從而定向的改變細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)和 特征。 同源重組技術(shù)的特點(diǎn)為： ①同源重組技術(shù)能把外源基因引入染色體 DNA的特定片段上，在設(shè)計(jì)合理的情況下，同源重組技術(shù)可對(duì)宿主細(xì)胞染色體基因進(jìn)行精細(xì)的改造； ②同源重組后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體 DNA 的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制。 技術(shù)特點(diǎn)或 創(chuàng)新點(diǎn) 本項(xiàng)目由于在 CBH II 上游加入不受葡萄糖抑制的真核啟動(dòng)子 PKI A，使 CBH II 不再受到培養(yǎng)基中葡萄糖影響，獲得高效表達(dá)，從而促進(jìn)其他纖維素酶基因的協(xié)同表達(dá)，較大幅度提高菌株在發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)纖維素酶的能力。 幾乎所有已克隆的纖 維素酶基因都已在大腸桿菌中得到表達(dá)。但是這一體系表達(dá)率低，產(chǎn)生的酶多數(shù)不能分泌到胞外。本項(xiàng)目成果使纖維素酶在原木霉宿主菌中獲得穩(wěn)定高效表達(dá)，可以用于大 13 規(guī)模培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)。 本項(xiàng)目對(duì)基因工程菌株的培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件進(jìn)行了摸索，嘗試進(jìn)行液體培養(yǎng)基深層發(fā)酵，通過(guò)分段控制 pH 值、溫度和溶解氧進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵 72 小時(shí)左右酶活達(dá)到最高，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶提供了參考。 技術(shù)研制報(bào)告 纖維素酶屬誘導(dǎo)型酶類其多個(gè)酶組分的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程， 其中 CBH II 具有關(guān)鍵的作用。據(jù)報(bào)道 ( Seiboth et )，當(dāng) CBH II 基因缺失時(shí)，會(huì)影響纖維素酶系其它酶的表達(dá)，而缺失 CBH I， EG III 等基因時(shí)，只影響自身的表達(dá)。另有研究表明CBH II 是木霉纖維素酶系統(tǒng)中最先表達(dá)的酶，其產(chǎn)物進(jìn)一步誘導(dǎo)纖維素酶其他酶如 CBH I， EG等酶基因的表達(dá)。而 CBH II基因的表達(dá)又受到葡萄糖的抑制 (Sternberg amp。 Mandel， 1979)，因此要提高木霉的纖維素酶的產(chǎn)酶能力就可以通過(guò)木霉 CBH II 基因克隆，將其構(gòu)建在不受葡萄糖抑制的真核啟動(dòng)子下游如 PKI， cDNA1等啟動(dòng)子，使 CBH II 不再受到培養(yǎng)基中葡萄糖影響而得到高效表達(dá)，從而促進(jìn)其他纖維素酶基因的協(xié)同表達(dá)，較大幅度提高菌株在發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)纖維素酶的能力。 由于木霉 菌 屬于半知菌，缺乏有性階段，對(duì)其雜交育種有一定困難。原生質(zhì)體育種是一種非常有效的方法，木霉的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與其他真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相似，多為使用細(xì)菌來(lái)源的質(zhì)粒構(gòu)建的載體，在聚乙二醇 14 （ PEG），山梨醇和氯化鈣作用下把目的基因或 DNA 片段引入受體原生質(zhì)體，經(jīng)過(guò)再生和選擇獲得轉(zhuǎn)化子。選用一個(gè)穩(wěn)定的選擇標(biāo)記對(duì)建立木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是非常必要的，木霉轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記包括營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記和顯性標(biāo)記兩類 。前者常用的如 PyrG 或 Pyr4，后者常用的有HmR， benA，和 amds。 本成果采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建成功高活力纖維素酶工程菌體，超過(guò)國(guó)內(nèi)目前使用的生產(chǎn)菌體的產(chǎn)酶能力，達(dá)到 了 國(guó)際先進(jìn)水平。 供試菌種 綠色木霉 G104 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室保藏。 啟動(dòng)子選擇 PKI A ()。 載體 pUT () 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，包含 Ben A 顯性標(biāo)記。 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 麥芽汁液體培 養(yǎng)基 pH ， 30℃，220r/min 培養(yǎng) 24h。 試劑 pGEMTeasyvector Kit 購(gòu)自 Promega 公司， Taq plus DNA polymerase 購(gòu)自上海生工公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega 公司。 真菌總 DNA 的提取 ①離心收集菌體，加入 400μ l DNA 提取液 (50mmol/L TrisHCl，； ， )； 15 ②充分振蕩后加入 100μ l 10%SDS 及 300μ l 氯化芐振蕩混勻，50℃ 保溫 1h，每隔 10min振蕩一次； ③加入 50μ l 3mol/L 醋酸鈉，離心，收集上清，用異丙醇沉淀得到總 DNA。 PCR 擴(kuò)增 CBH II 序列 ①根據(jù)已知綠色木霉 cDNA 序列，設(shè)計(jì) PCR引物，由上海生工公司合成； ② PCR 擴(kuò)增：用標(biāo)準(zhǔn) PCR反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR反應(yīng)。 PCR循環(huán)條件：預(yù)變性 94℃ 3min， 94℃ 變性 50s， 51℃ 復(fù)性 50s，72℃ 延伸 1min20s， 35 個(gè)循環(huán)后再延伸 8min。 重組質(zhì)粒載體 pUTCBH的構(gòu)建 ①用 Gel extraction試劑盒從膠中回收 PCR產(chǎn)物，得到約 的 CBH II 片段，將其用 Klenow酶補(bǔ)平后回收純化。 ②將 pUT 質(zhì)粒載體在多克隆位點(diǎn)用 EcoR I限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生的 3’粘性突出末端用 Klenow 酶補(bǔ)平并將其回收純化，將上述兩個(gè)片段以合適的比例建立反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，獲得重組質(zhì)粒載體 pUTCBH。對(duì)篩選到的重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶和 PCR 進(jìn)行鑒定分析，所擴(kuò)增的片段含有完整的 CBH II 序列。 16 重組質(zhì)粒載體 pUTCE 的構(gòu)建 將 pUTCBH 質(zhì)粒載體在用 EcoR V 限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生的 3’粘性突 出末端用 Klenow酶補(bǔ)平并將其回收純化，與 PKI A 片段以合適的比例建立反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，獲得具有 PKI A 啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒載體 pUTCE。 17 pUTCE重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及重組菌的篩選 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌 G104，利用 Ben A 顯性標(biāo)記進(jìn)行初篩；而后進(jìn)一步采用液體搖瓶培養(yǎng)檢測(cè)發(fā)酵液復(fù)篩，獲得一株表達(dá)量較高的重組菌，命名為 G104CE。 液體培養(yǎng)基深層發(fā)酵 在 10 L的通氣機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中，接種量為 10%，發(fā)酵過(guò)程采取分段控制 pH 值、溫度和溶解氧的工 藝，發(fā)酵 72h 左右酶活力最高，實(shí)驗(yàn)室樣品酶活力達(dá)到：液體 3200u/ml。 18 技術(shù)的先進(jìn)性 蛋白質(zhì)基因 同源 重組技術(shù)是國(guó)家