【正文】 吉林市地處邊疆近海省，自然環(huán)境優(yōu)越，是我國最具魅力的城市之一，是福布斯排行榜評價最適合發(fā)展工業(yè)的城市，是吉林省玉米，水稻的主要產(chǎn)區(qū)之一。但是 ，吉林市經(jīng)濟發(fā)展不平衡，缺少生物工程高新技術項目。引進生物工程高新技術企業(yè)， 扶持 地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭項目是吉林市經(jīng)濟發(fā)展的重大舉措之一，因此，該項目成為吉林市政府和吉林高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)重點招商引資項目。 有利于資源再利用 、 發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟 、提高資源經(jīng)濟價值 玉米及其它糧食秸稈多年以來一直作為廢棄物或燃料，其經(jīng)濟價值幾乎趨于零?；蛑亟M纖維素酶項目采用的主要原料是玉米秸稈。這一資源是可再生資源，經(jīng)過粗加工，每噸玉米秸稈價格可以達到600— 900 元，而制成纖維素酶，以粗加工的 秸稈為基數(shù)，每噸秸稈產(chǎn)生的價值可 提升十倍左右，提高了資源利用率，提升了資源的經(jīng)濟價值。 市場分析 該項目產(chǎn)品的 主要應用領域 為 飼料 、麻棉 紡織 、 制 藥 、 生物發(fā)酵等行業(yè)，該項目產(chǎn)品是上述行業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中不可或缺的添加劑。 據(jù) 不完全 統(tǒng)計 ，國內(nèi)市場纖維素酶年需求大約 12 萬噸以上， 05年至 06 年該類產(chǎn)品年需求增幅為 38％；國際市場年需求大約 40 萬 8 噸，主要集中在歐美地區(qū)，占國際市場總消耗量的 70％，而且需求量正在以每年 8％的速度增長。此外，除燃料酒精行業(yè)外，用戶直接使用的是復合酶，纖維素酶在復合酶中添加比例一般為 80％左右，因此，纖維素酶市場需求量 的統(tǒng)計一般以復合酶用量為依據(jù)。復合酶年用量統(tǒng)計如下（詳見附件）： 飼料行業(yè)： 我國年產(chǎn)飼料 1 億噸左右，按每噸飼料添加 公斤復合酶計算，年復合酶用量約為 5 萬噸左右，其中纖維素酶添加量為 4 萬噸左右。 麻棉紡織行業(yè)： 我國洗滌復合酶年用量 2 萬噸左右， 其中纖維素酶添加量為 。 啤酒行業(yè)： 我國年產(chǎn)啤酒 3500萬噸左右，需大麥或小麥 160萬噸，按每噸添加 ，啤酒復合酶年用量 萬噸左右，其中纖維素酶添加量為 2萬噸左右。 燃料酒精行業(yè)： 該行業(yè)為纖維素酶潛在的巨大市 場。目前我國年產(chǎn)燃料酒精 160 萬噸，預計 2020年年產(chǎn)量將達到 800— 900 萬噸 。纖維酶是生產(chǎn)非糧燃料酒精必須使用的催化劑，按每 6噸原料生產(chǎn) 1噸燃料酒精計算，預計 2020 年，秸稈等非糧原料年用量最少 4800 萬噸，纖維素酶投料比按每噸原料 3‰計算，年需求量將達到 14 萬噸左右。 產(chǎn)品銷售 酶制劑生產(chǎn)廠家一般不直接面對終端用戶，只面對銷售代理商。 9 因此，我公司現(xiàn)階段只向相關代理商銷售產(chǎn)品并已簽訂了意向協(xié)議，相關情況如下： 國內(nèi)銷售： 我公司已經(jīng)和最大的銷售商夏盛集團簽訂了意向銷售合同，夏盛集團還出具了產(chǎn)品包 銷承諾書及該公司和用戶簽訂的銷售合同及供貨計劃。 產(chǎn)品出口： 我公司正在和 杰能科 公司、嘉吉公司進行 接洽，公司經(jīng)營副總曾任杰能科公司技術負責人，熟悉國外市場，產(chǎn)品 出口前景廣闊。 與國家高技術產(chǎn)業(yè)化專項總體思路、原則、目標等關聯(lián)情況 該項目屬于生物技術類，是 國務院辦公廳《生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展“十一五”規(guī)劃》（國辦發(fā) [20xx]23號）微生物技術專項重點支持項目；是國家科技部科技支撐計劃 “生物技術產(chǎn)品中試與規(guī)模化生產(chǎn)配套技術與工藝的研究與示范” 重點支持項目；該項目 20xx 年 已經(jīng)列入吉林省科技發(fā)展計劃，分別被評為重大和重 點項目并獲得省長基金支持；該項目是地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭項目，是國債資金重點支持的項目。 二、項目技術基礎 項目成果來源及知識產(chǎn)權情況 科大公司與中國科技大學易元生物技術有限公司合作，取得了基因重組纖維素酶原始菌株構建技術和菌株的使用權（詳見附件《專利的專有技術使用合同》）。 由科大公司提供原始菌株、菌株構建技術及工藝方案，與吉林農(nóng)業(yè)大學合作，取得了基因重組纖維素酶第二代工程菌株及菌株 10 構建技術的所有權（詳見附件《技術合同》）。 已完成的研究開發(fā)工作及中試情況和鑒定年限 本項目 已完 成基因重組纖維素酶工程菌株構建，該菌株 現(xiàn) 保存于吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院實驗室深凍冰箱中。 20xx 年初 已經(jīng)在吉林 農(nóng)業(yè)大學 完成了中試，中試結果與實驗室試驗結果一致（詳見 吉林農(nóng)業(yè)大學生化實驗室《檢測報告》 ）。 中試及小規(guī)模生產(chǎn)樣品已交付用戶 使 用，用戶已出具使用報告（詳見《 寧夏夏盛果汁果酒酶有限公司傳真函 》） 。 科大公司技術專家已經(jīng) 針對基因重組纖維素酶生產(chǎn)工藝條件 開發(fā)了 連續(xù)發(fā)酵等生產(chǎn)工藝。此外，公司技術專家有十年以上纖維素酶生產(chǎn)經(jīng)驗，已經(jīng) 掌握了成熟的纖維素酶生產(chǎn)工藝，因此，可以實現(xiàn)產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)。 公司專家已經(jīng)設計了纖維素酶系列產(chǎn)品生產(chǎn)線，主體設備及內(nèi)部構件和管路連接已經(jīng)完成。配套設備及 GMP 裝飾工程完工后即可投入生產(chǎn)。 必要的說明。 纖維素酶工程菌株的構建采用的是國際前沿的生物工程技術及基因打靶技術，但是，酶制劑生產(chǎn)工藝是公知技術。此外，生產(chǎn)過程的發(fā)酵條件優(yōu)于實驗室條件，因此，只要中試設定條件與生產(chǎn)工藝條件一致，那么，所生產(chǎn)出來的產(chǎn)品性能將優(yōu)于中試。 技術或工藝特點以及與現(xiàn)有技術或工藝比較所具有的優(yōu)勢 技術 原理 纖維素酶 11 自然界中纖維素的降解需要內(nèi)切 葡聚糖酶和外切葡聚糖酶共同作用。纖維素降解過程首先被外切纖維素酶的 CBD吸附到不溶性纖維素表面，使結晶結構的纖維素長分子鏈開裂，聚集結構解聚，長鏈分子末端部分發(fā)生游離從而為纖維素水解酶類的作用提高了可及性和反應性，從而使纖維素易于水化；之后內(nèi)切酶作用于經(jīng)外切活化的纖維素，分解其β 1， 4 鍵，產(chǎn)生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖。在內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β 1， 4葡萄糖苷酶的協(xié)同作用下，纖維素的β 1， 4糖苷鍵逐步水解，形成纖維寡糖和葡萄糖。其催化機理與溶菌酶相似，糖苷配基的脫去涉及 2 個保守羧基氨基酸分別作為質(zhì)子供體和親核試劑執(zhí)行酸堿催化的雙置換反應；谷氨酸位于細菌和真菌 CBH， EG 及葡萄糖苷酶的活性位點。協(xié)同作用其作用順序不是絕對按各酶的功能也不是簡單固定的。 CBH 和 EG 都能引起纖維素的分散和脫纖化，因此纖維素的結晶結構被打亂導致變形，使纖維素酶能深入纖維素分子界面之間，從而使纖維素孔壁、腔壁和微裂隙壁的壓力增大，水分子的介入又使纖維素分子之間的氫鍵被破壞，產(chǎn)生部分可溶性的纖維的微結晶，利于進一步降解。 基因的同源重組技術 基因的同源重組技術（ homologous rebination），又 稱基因打靶（ gene targeting），指外源 DNA與受體細胞染色體 DNA 上的同源序列之 間 發(fā)生重組并整合在預定位點上，從而改變細胞遺傳特性的方法。 12 根據(jù)重組后靶基因的特征可以分為兩種類型： ①由于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有結構被破壞，此即為基因破壞或剔除； ②靶基因的全部序列為新的基因所取代。這一新興技術 已 被證明為目前能精確的修飾基因組的最有效方法，從理論上講它將使人類能按設計對極其復雜的細胞基因組結構進行定點、定量的改變，從而定向的改變細胞的遺傳結構和 特征。 同源重組技術的特點為： ①同源重組技術能把外源基因引入染色體 DNA的特定片段上，在設計合理的情況下，同源重組技術可對宿主細胞染色體基因進行精細的改造； ②同源重組后被擊中的基因或新引入的基因隨染色體 DNA 的復制而穩(wěn)定復制。 技術特點或 創(chuàng)新點 本項目由于在 CBH II 上游加入不受葡萄糖抑制的真核啟動子 PKI A，使 CBH II 不再受到培養(yǎng)基中葡萄糖影響，獲得高效表達，從而促進其他纖維素酶基因的協(xié)同表達，較大幅度提高菌株在發(fā)酵過程中的產(chǎn)纖維素酶的能力。 幾乎所有已克隆的纖 維素酶基因都已在大腸桿菌中得到表達。但是這一體系表達率低，產(chǎn)生的酶多數(shù)不能分泌到胞外。本項目成果使纖維素酶在原木霉宿主菌中獲得穩(wěn)定高效表達，可以用于大 13 規(guī)模培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)。 本項目對基因工程菌株的培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件進行了摸索，嘗試進行液體培養(yǎng)基深層發(fā)酵，通過分段控制 pH 值、溫度和溶解氧進行發(fā)酵，發(fā)酵 72 小時左右酶活達到最高，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶提供了參考。 技術研制報告 纖維素酶屬誘導型酶類其多個酶組分的表達調(diào)控是一個非常復雜的過程， 其中 CBH II 具有關鍵的作用。據(jù)報道 ( Seiboth et )，當 CBH II 基因缺失時，會影響纖維素酶系其它酶的表達，而缺失 CBH I， EG III 等基因時，只影響自身的表達。另有研究表明CBH II 是木霉纖維素酶系統(tǒng)中最先表達的酶，其產(chǎn)物進一步誘導纖維素酶其他酶如 CBH I， EG等酶基因的表達。而 CBH II基因的表達又受到葡萄糖的抑制 (Sternberg amp。 Mandel， 1979)，因此要提高木霉的纖維素酶的產(chǎn)酶能力就可以通過木霉 CBH II 基因克隆，將其構建在不受葡萄糖抑制的真核啟動子下游如 PKI， cDNA1等啟動子，使 CBH II 不再受到培養(yǎng)基中葡萄糖影響而得到高效表達，從而促進其他纖維素酶基因的協(xié)同表達，較大幅度提高菌株在發(fā)酵過程中的產(chǎn)纖維素酶的能力。 由于木霉 菌 屬于半知菌，缺乏有性階段，對其雜交育種有一定困難。原生質(zhì)體育種是一種非常有效的方法，木霉的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與其他真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相似，多為使用細菌來源的質(zhì)粒構建的載體，在聚乙二醇 14 （ PEG），山梨醇和氯化鈣作用下把目的基因或 DNA 片段引入受體原生質(zhì)體，經(jīng)過再生和選擇獲得轉(zhuǎn)化子。選用一個穩(wěn)定的選擇標記對建立木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是非常必要的，木霉轉(zhuǎn)化的選擇標記包括營養(yǎng)缺陷型標記和顯性標記兩類 。前者常用的如 PyrG 或 Pyr4，后者常用的有HmR， benA，和 amds。 本成果采用先進的分子生物學技術，構建成功高活力纖維素酶工程菌體，超過國內(nèi)目前使用的生產(chǎn)菌體的產(chǎn)酶能力，達到 了 國際先進水平。 供試菌種 綠色木霉 G104 中國科學技術大學生命科學學院基因工程實驗室保藏。 啟動子選擇 PKI A ()。 載體 pUT () 中國科學技術大學生命科學學院基因工程實驗室構建，包含 Ben A 顯性標記。 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 麥芽汁液體培 養(yǎng)基 pH ， 30℃，220r/min 培養(yǎng) 24h。 試劑 pGEMTeasyvector Kit 購自 Promega 公司， Taq plus DNA polymerase 購自上海生工公司，限制性內(nèi)切酶購自Promega 公司。 真菌總 DNA 的提取 ①離心收集菌體，加入 400μ l DNA 提取液 (50mmol/L TrisHCl，； ， )； 15 ②充分振蕩后加入 100μ l 10%SDS 及 300μ l 氯化芐振蕩混勻，50℃ 保溫 1h，每隔 10min振蕩一次； ③加入 50μ l 3mol/L 醋酸鈉，離心，收集上清，用異丙醇沉淀得到總 DNA。 PCR 擴增 CBH II 序列 ①根據(jù)已知綠色木霉 cDNA 序列，設計 PCR引物，由上海生工公司合成； ② PCR 擴增：用標準 PCR反應體系進行 PCR反應。 PCR循環(huán)條件：預變性 94℃ 3min， 94℃ 變性 50s， 51℃ 復性 50s，72℃ 延伸 1min20s， 35 個循環(huán)后再延伸 8min。 重組質(zhì)粒載體 pUTCBH的構建 ①用 Gel extraction試劑盒從膠中回收 PCR產(chǎn)物，得到約 的 CBH II 片段，將其用 Klenow酶補平后回收純化。 ②將 pUT 質(zhì)粒載體在多克隆位點用 EcoR I限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生的 3’粘性突出末端用 Klenow 酶補平并將其回收純化，將上述兩個片段以合適的比例建立反應體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，獲得重組質(zhì)粒載體 pUTCBH。對篩選到的重組質(zhì)粒用內(nèi)切酶和 PCR 進行鑒定分析，所擴增的片段含有完整的 CBH II 序列。 16 重組質(zhì)粒載體 pUTCE 的構建 將 pUTCBH 質(zhì)粒載體在用 EcoR V 限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生的 3’粘性突 出末端用 Klenow酶補平并將其回收純化，與 PKI A 片段以合適的比例建立反應體系，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，獲得具有 PKI A 啟動子的重組質(zhì)粒載體 pUTCE。 17 pUTCE重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及重組菌的篩選 將構建的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌 G104，利用 Ben A 顯性標記進行初篩；而后進一步采用液體搖瓶培養(yǎng)檢測發(fā)酵液復篩，獲得一株表達量較高的重組菌，命名為 G104CE。 液體培養(yǎng)基深層發(fā)酵 在 10 L的通氣機械攪拌發(fā)酵罐中，接種量為 10%，發(fā)酵過程采取分段控制 pH 值、溫度和溶解氧的工 藝，發(fā)酵 72h 左右酶活力最高，實驗室樣品酶活力達到：液體 3200u/ml。 18 技術的先進性 蛋白質(zhì)基因 同源 重組技術是國家