20xx年醫(yī)學(xué)專題—第二章--細(xì)胞破碎與提取要點(diǎn)-文庫(kù)吧
2024-11-13 12:10 本頁(yè)面
【正文】 (jiě fǎ),2． 外加酶法 將細(xì)胞壁分解，使內(nèi)含物釋放出來(lái)。 細(xì)菌：加溶菌酶（結(jié)合反復(fù)(fǎnf249。)凍融或加EDTA） 酵母：采用β葡聚糖酶 霉菌：添加幾丁質(zhì)酶 植物材料：加纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。,1． 自溶法 保溫一定時(shí)間，通過(guò)(tōnggu242。)細(xì)胞本身的酶將細(xì)胞破壞。,第十九頁(yè)，共九十二頁(yè)。,例：外源蛋白(d224。nb225。i)在大腸桿菌中的積累,三、包含(bāoh225。n)體及其純化,第二十頁(yè)，共九十二頁(yè)。,包涵體（inclusion bodies），或包含體，是無(wú)定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包涵體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包涵體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞(p242。hu224。i)，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞(p242。hu224。i)。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。,第二十一頁(yè)，共九十二頁(yè)。,包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物(chǎnw249。)。這些基因表達(dá)產(chǎn)物(chǎnw249。)沒(méi)有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物(chǎnw249。)，必需分離包涵體后，溶解包涵體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（protein folding）機(jī)理研究提出了新的課題。,第二十二頁(yè)，共九十二頁(yè)。,重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開(kāi)辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們?cè)诜蛛x純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長(zhǎng)激素、白細(xì)胞介素－６、人γ－干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚(n237。ngj249。)成沒(méi)有生物活性的固體顆粒－包涵體（inclusion bodies IBs)。,第二十三頁(yè)，共九十二頁(yè)。,包含(bāoh225。n)體的構(gòu)成,基因表達(dá)(biǎod225。)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。,分離包含體后，需使目標(biāo)(m249。biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。（蛋白質(zhì)折疊）,包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。,第二十四頁(yè)，共九十二頁(yè)。,包含(bāoh225。n)體特點(diǎn):,是無(wú)定形的蛋白質(zhì)的聚集(j249。j237。)，不被任何膜所包圍。,包含(bāoh225。n)體難溶于水，易溶于變性劑（如鹽酸胍、脲）。,細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，離心（5000 20000g 15min）就可以沉淀。,第二十五頁(yè)，共九十二頁(yè)。,幾種常見(jiàn)的工藝(gōngy236。)路線（一）,機(jī)械(jīxi232。)破碎 (高壓勻漿、高速珠磨）,差速離心提取(t237。qǔ)出包含體,加變性劑溶解,除變性劑復(fù)性,基因工程包含體的純化方法,第二十六頁(yè)，共九十二頁(yè)。,路線(l249。xi224。n)1 的特點(diǎn),特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開(kāi)，擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單(jiǎndān)。 缺點(diǎn):要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。,基因工程包含(bāoh225。n)體的純化方法,第二十七頁(yè)，共九十二頁(yè)。,幾種(jǐ zhǒnɡ)常見(jiàn)的工藝路線（二）,機(jī)械(jīxi232。)破碎,膜分離除可溶性蛋白(d224。nb225。i),加變性劑溶解包含體,除變性劑復(fù)性,基因工程包含體的純化方法,第二十八頁(yè)，共九十二頁(yè)。,路線(l249。xi224。n)2 的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了膜分離技術(shù)(j236。sh249。)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染。,基因工程包含(bāoh225。n)體的純化方法,缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。,第二十九頁(yè)，共九十二頁(yè)。,幾種(jǐ zhǒnɡ)常見(jiàn)的工藝路線（三）,化學(xué)(hu224。xu233。)破碎 （加變性劑）,離心除細(xì)胞(x236。bāo)碎片,除變性劑復(fù)性,基因工程包含體的純化方法,第三十頁(yè)，共九十二頁(yè)。,路線(l249。xi224。n)3 特點(diǎn)：,基因工程(jīyīn gōngch233。ng)包含體的純化方法,優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法破碎，所采用的試劑(sh236。j236。)既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。,缺點(diǎn)：所有的可溶性雜質(zhì)都沒(méi)有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來(lái)困難。,第三十一頁(yè)，共九十二頁(yè)。,一、概述(ɡ224。i sh249。),第四節(jié) 萃取(cu236。qǔ),基本概念及分類 概念：萃取是利用(l236。y242。ng)溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的技術(shù)。,第三十二頁(yè)，共九十二頁(yè)。,液固萃取(cu236。qǔ),液液萃取(cu236。qǔ),化學(xué)(hu224。xu233。)萃取,物理萃取,雙水相萃取,超臨界萃取,萃取原理,參與溶質(zhì) 分配的兩 相不同,分類：,第三十三頁(yè)，共九十二頁(yè)。,概念：用某種溶劑(r243。ngj236。)把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過(guò)程稱為固液萃取，也稱浸取或浸出。,應(yīng)用： 用溫水從甜菜中提取糖， 用有機(jī)溶劑從大豆(d224。d242。u)、花生等油料作物中提取食用油， 用水或有機(jī)溶劑從植物中提取藥物、香料或色素等。,液固萃取(cu236。qǔ),第三十四頁(yè)，共九十二頁(yè)。,用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)(w249。zh236。)叫液液萃取，也稱溶劑萃取。經(jīng)典的液液萃取指的是有機(jī)溶劑萃取,液液萃取(cu236。qǔ),有機(jī)溶劑萃取法廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模(guīm243。
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