20xx年醫(yī)學專題—第四章-細胞破碎-文庫吧
2024-11-16 00:59 本頁面
【正文】 CHEMICAL METHODS 化學(hu224。xu233。)方法,16,第十六頁，共六十八頁。,表4.11介紹了主要的幾種化學方法，有滲透沖擊法，表面活性劑增溶法、脂溶法。首先(shǒuxiān)簡單的介紹一下酶消化法和堿處理法。,17,第十七頁，共六十八頁。,酶消化法和堿處理法都是細胞破碎的有效方法(fāngfǎ)，但是也都有各自的缺點。,18,第十八頁，共六十八頁。,1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用(l236。y242。ng)溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用(l236。y242。ng)滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。 1）外加酶法,19,第十九頁，共六十八頁。,外加(w224。ijiā)酶法,有時采用幾種酶的混合物會產生更好的效果，加入時需確定相應的次序。 對酵母(ji224。omǔ)細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質甘露聚糖結構，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內產物。,20,第二十頁，共六十八頁。,外加(w224。ijiā)酶法,酶解法的特點是專一性強，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據細胞的結構和化學組成來選擇。 溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的β1,4糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產生溶壁現象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。 放線菌的細胞壁結構類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶， 酵母和真菌由于(y243。uy)細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。 植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。,21,第二十一頁，共六十八頁。,酶解法(jiě fǎ)的特點,優(yōu)點： 發(fā)生酶解的條件溫和(wēnh233。) 能選擇性地釋放產物 胞內核酸等泄出量少，細胞外形較完整,缺點： 溶酶價格高， 溶酶法通用性差（不同(b249。 t243。nɡ)菌種需選擇不同(b249。 t243。nɡ)的酶) 產物抑制的存在。,22,第二十二頁，共六十八頁。,堿處理法和酶消化(xiāohu224。)法相反，反應激烈，不具選擇性，而且較便宜。堿加入細胞懸浮液中后和細胞壁進行了多種反應，包括使磷脂皂化。,23,第二十三頁，共六十八頁。,堿能溶解細胞壁上脂類物質或使某些組分從細胞內滲漏出來(chū l225。i)。 成本低，反應激烈，不具選擇性。,堿處理(chǔlǐ)法,24,第二十四頁，共六十八頁。,1）滲透壓沖擊(chōngjī)法,滲透壓沖擊是較溫和的一種(yī zhǒnɡ)破碎方法， 將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將介質快速稀釋，或將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。,25,第二十五頁，共六十八頁。,滲透流的動力來自滲透壓，滲透壓可能很大?？梢?kěyǐ)通過化學平衡來估算，水的化學電勢是常數，即： 181。H20 (outside) = 181。H20 (inside) (4.31),26,第二十六頁，共六十八頁。,細胞外純水的化學電勢包括標準化學電勢和壓力修正項；與之平衡的胞內的化學電勢包括三項，即標準化學電勢、壓力修正相和濃度修正項。對于理想(lǐxiǎng)的不可壓縮溶液，這些修正相和式（4.21）可改寫為： 181。0 H20+VH2oPout = 181。0 H20+VH2oPin+RT ln(1x1) (4.32),27,第二十七頁，共六十八頁。,181。0H20——標準化學電勢 VH2o——水的偏摩爾體積 x1——細胞內所有溶質的總摩爾(m243。 ěr)分數 若包內物為稀溶液，其偏摩爾體積等于純水的摩爾體積。且x1很小時就有：,28,第二十八頁，共六十八頁。,PoutPin=(RT/VH2o)ln(1x1) =(RT/VH2o) (x1…) =RTc1+ … (4.33) 該式稱為(chēnɡ w233。i)范特苛夫定律。,29,第二十九頁，共六十八頁。,由該方程知細胞內壓力必須(b236。xū)小于細胞外壓力，否者，水會流入細胞內，溶破細胞。我們可以采用等式4.23 估算出滲透壓的大小。許多細胞內溶質濃度大約為0.1M NaCl 或0.2M溶質 。 由此
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