【正文】 6. 基因甲基化的改變 1. 轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） 在漫長的生物進(jìn)化過程中，現(xiàn)在的逆轉(zhuǎn)錄病毒的祖先在感染正常細(xì)胞的同時，通過復(fù)雜的遺傳學(xué)重組和突變，將正常細(xì)胞的細(xì)胞癌基因整合到其基因組中，并使之改變成活化的病毒癌基因。帶有病毒癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒在感染適當(dāng)?shù)膭游飼r，可使之發(fā)生腫瘤。 2. 點(diǎn)突變（ point mutation） 美國的 Weinberg， Wigler和 Cooper等實(shí)驗室于 1983 年分別從不同的膀胱癌細(xì)胞系中分離 DNA，用以轉(zhuǎn)染 NIH／ 3T3細(xì)胞系，可使之發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中已分離到活化癌基因的分子克隆，并證明其與 Harvey鼠肉瘤病毒的癌基因 （ vHaras）非常相似。 在人類正常細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了其對應(yīng)物(cHaras), Barbacid與 Weinberg的研究組分別發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中的活化癌基因與其對應(yīng)的正常癌基因之間只有一個堿基對的差別，即 (cHaras)基因的第一個外顯子 (exon)所編碼的多肽鏈氨基端第 12位密碼子上發(fā)生了有突變，其鳥瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其編碼的甘氨酸被氨酸所取代。這一單個堿基對的點(diǎn)突變，看來就是正常細(xì)胞癌基因變成活化癌基因的關(guān)鍵。 3. 插入突變（ insertional mutation) 逆轉(zhuǎn)錄病毒中的慢病毒本身不含有癌基因，但能以前病毒的形式插入到宿主細(xì)胞癌基因的鄰近而將其激活。 在這方面最典型的例子是禽白血細(xì)胞增多癥病毒（ AW）。新生雛雞在感染 ALV后 6～ 12月才產(chǎn)生腫瘤，在癌前期觀察到法氏囊中大量細(xì)胞受到病毒感染，而且 ALV的 DNA插入到不同細(xì)胞基因組的不同位點(diǎn)。 但是，在腫瘤細(xì)胞中前病毒 DNA卻存在于所有細(xì)胞基因組的同一位點(diǎn)，說明它們是由ALV的 DNA插入基因組適當(dāng)位點(diǎn)的一個細(xì)胞所形成的克隆。在腫瘤細(xì)胞中 ALV的 DNA可發(fā)生部分缺失，但至少項保存一部分。 Hayward等進(jìn)一步證明，在大多數(shù)腫瘤中 ALV前病毒插入到細(xì)胞癌基因的 5`端，并處于相同的轉(zhuǎn)錄方向。 ALV前病毒的長末端序列（ LTR）經(jīng)常缺失或失活，所以可能其 3`端 LTR為轉(zhuǎn)錄提供強(qiáng)有力的啟動子，從而產(chǎn)生大量與前病毒 DNA相連的 cmyc序列。 在有些情況下，前病毒雖插入到 cmyc的 5`端，但處于相反的轉(zhuǎn)錄方向，或插入到的 3`端而處于相同的轉(zhuǎn)錄方向。這兩種情況也可加強(qiáng)c－ mvc的轉(zhuǎn)錄，但其作用機(jī)理尚不太清楚。 同時 CooPer等發(fā)現(xiàn)，從這類腫瘤中提取的DNA可轉(zhuǎn)化 NIH／ 3T3細(xì)胞，但奇怪的是，從中分離到的轉(zhuǎn)化基因既不是 ALV的 DNA，也不是活化的 cmyc，而是位于另一位點(diǎn)的片段，稱之為 Blym，它編碼一個分子量約為 7kD的多肽。 由此可見，在誘發(fā)的腫瘤中至少涉及兩個癌基因的活化。 (translocation) 在人類巴基特淋巴瘤的細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)第 8號染色體長臂遠(yuǎn)端片段易位至第 2， 22和 14號染色體的一定部位。 現(xiàn)有資料證明，這些部位分別含有免疫球蛋白輕鏈 Igκ , Ig λ 和以及重鏈 IgH基因。由于這些部位經(jīng)常進(jìn)行著活躍的轉(zhuǎn)錄，可以提供強(qiáng)有力的啟動子，而易位的第 8號染色體片段已證明含有細(xì)胞癌基因 cmyc,可以被相鄰的啟動子活化。 還有資料指出．易位的 cmyc的 3`端與免疫球蛋白基因的 3`端相連。這一情況類似于上述ALV前病毒的插入，即 cmyc插入到啟動子的下游，但處于相反的轉(zhuǎn)錄方向。 5．基因擴(kuò)增（ gene amplification） 在人的慢粒白血病細(xì)胞系（ HL60）中，發(fā)現(xiàn)了 cmyc的擴(kuò)增，表現(xiàn)為雙微體（ dounle minutes， DMs）和均染區(qū)（ Homogeneous staning region,HSR）的形成，可通過原位雜交法加以證實(shí)。 6. 基因甲基化的改變 在腫瘤細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因的甲基化改變，表現(xiàn)為癌基因的低甲基化或去甲基化，或抑癌基因的異常甲基化。有報道在胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 cHaras癌基因的低甲基化，而低甲基化可導(dǎo)致 cHaras癌基因的過度表達(dá)。 第二節(jié) 抑癌基因 抑癌基因 (antioncogene)過去常稱之為腫瘤抑制基因（ tumor suppressor gene）。關(guān)于抑癌基因存在的概念由來以久，人們最初從腫瘤細(xì)胞染色體特定部位的缺失推測它的存在。 細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展在這方面提供了進(jìn)一步的證據(jù)。當(dāng)用正常細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞雜交，或?qū)⒛骋粭l正常細(xì)胞染色體導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞中時，觀察到腫瘤細(xì)胞的惡性表型受到抑制，從而推測在正常細(xì)胞染色體上存在著抑癌基因。 但最終確定其存在，必須分離到抑癌基因，并對其結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行詳細(xì)的分析。 1986~l987年國際上有 3個實(shí)驗室成功地分離到第一個抑癌基因 —— Rb基因的 cDNA克?。畯亩挂职┗蜓芯窟M(jìn)入了分子生物學(xué)時代。 近年來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些新的抑癌基因。目前對抑癌基因尚無明確分類，但近年來由于抑癌基因數(shù)量的增多，而其中一些基因在功能上與傳統(tǒng)的抑癌基因有很大的不同，為便于了解起見，現(xiàn)將其分成兩大類： 表現(xiàn)為喪失功能的抑癌基因（傳統(tǒng)的抑癌基因） Rb基因 FAP 相關(guān)的抑癌基因 p53基因 p21Cipl基因 p73基因 p27Kipl NF1基因 FHIT基因 WT1基因 PTEN ErbA基因 Kreyl基因 DPC4基因 INK4基因 參與 DNA修復(fù)抑癌基因（新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因） 錯配修復(fù)基因 BRCA1基因 ATM基因 一 、表現(xiàn)為喪失功能的抑癌基因 1. Rb基因 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 (retinoblastoma)是嬰幼兒眼惡性腫瘤中最常見的一種。大量研究資料證明，位于人類細(xì)胞第 13號染色體長臂 13ql4區(qū)域的 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因（ retinoblastoma susceptibility gene， Rb） 的缺失或失活，是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要原因。 Rb基因在遺傳學(xué)上是隱性的，即必須兩個等位基因同時缺失形成所謂的缺失純合子，或一個等位基因缺失而另一基因突變而失活，才能導(dǎo)致基因功能的喪失。 等位基因的缺失或失活可由以下情況引起： 染色體丟失（ 13 ） 染色體部分缺失（ 13q ） 等位基因突變（ 13qRB→ I3qrb） 因此，腫瘤細(xì)胞的基因型有以下幾種可能性： 13qrb／ 13qrb 13qrb／ 13q 13qrb／ 13 13q ／ 13q 13 ／ 13 有關(guān)脂酶 D（ esterase D， ED）的研究究揭示了一個饒有興趣的現(xiàn)象。某些視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者的紅細(xì)胞脂酶 D活性只有正常人的一半，而在瘤細(xì)胞中則其活性為 0。 這一現(xiàn)象提示，脂酶 D基因與 Rb基因緊密連鎖， Rb基因的缺失導(dǎo)致脂酶 D活性的相應(yīng)下降。 同時提示，在體細(xì)胞中可能只有一個等位基因缺失，而另一個則是正常的，其基因型可能是 13q ／ l3RB。體細(xì)胞中的正常等位基因如發(fā)生突變而失活，則可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，其基因型變成 13q ／ l3rb。 脂酶 D的研究不僅為闡明腫瘤發(fā)生的機(jī)理提供了有力的依據(jù)，更重要的是，脂酶 D基因與 Rb基因的緊密連鎖，為 Rb基因的分離鋪平了道路。 Lee等于 1987年首次成功地分離到了 Rb基因的 cDNA分子克?。? 以脂酶 D的基因組 DNA分子克隆為起點(diǎn)，將其兩側(cè)遠(yuǎn)端的 DNA片段作為探針，用染色體步移（ Chromosome walking）的方法．從人胚視網(wǎng)膜和胎盤的 cDNA文庫中篩選 Rb的相關(guān)基因。 經(jīng)過反復(fù)篩選，獲得了一個與脂酶 D相鄰的，編碼 46kb mRNA基因，定名為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因，簡稱 Rb基因。 檢查了 6例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病人，發(fā)現(xiàn)其中 2例基因完全不表達(dá)，其他 4例則表達(dá)下降，而且表達(dá)的 mRNA分子長度減少至 ，對進(jìn)行序列分析的結(jié)果表明，它編碼一個含816氨基酸殘基的蛋白，經(jīng)計算機(jī)檢索未發(fā)現(xiàn)與該基因同源的序列。 以后各國學(xué)者對 Rb基因的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了大量的研究： 現(xiàn)已明確， Rb基因的基因組 DNA總長為200kb，有 27個外顯子，轉(zhuǎn)錄為 mRNA，編碼含 928氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其分子量為110~114kD。 常見的三種蛋白產(chǎn)物的分子量分別為 110kD 未磷酸化形式 112kD 磷酸化形式 114kD 其磷酸化程度在細(xì)胞周期中發(fā)生周期性變化： G0 期、 G1期 蛋白未磷酸化 S期、 G2期 大多數(shù)蛋白已磷酸化 Rb蛋白磷酸化程度與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cde2／ cde28的活性呈正相關(guān)。 未磷酸化型 Rb蛋白可能是抑制細(xì)胞增殖的活性型。 Rb基因可與某些 腫瘤病毒 的轉(zhuǎn)化蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其中包括 SV40抗原，腺病毒EIA蛋白和人乳頭瘤病毒 E6/E7蛋白，故可能對腫瘤病毒的轉(zhuǎn)化起抑制作用。 Rb蛋白還可以對細(xì)胞內(nèi) 轉(zhuǎn)錄因子、生長因子 起調(diào)控作用： 研究資料表明，在正常細(xì)胞內(nèi)可能存在著Rb蛋白的靶蛋白。例如，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶能同 Rb基因的 LT/EIA結(jié)合，這種結(jié)合同Rb蛋白的生長抑制功能有關(guān)。一旦 Rb蛋白同SV40或腺病毒基因組的相應(yīng)部位結(jié)合，或在位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變，就可能喪失其生理功能。 轉(zhuǎn)錄因子 E2F也能與 Rb蛋白形成復(fù)合物，故 Rb蛋白可通過同樣的機(jī)理來調(diào)節(jié) E2F因子的轉(zhuǎn)錄活性。 另外， Rb基因可抑制細(xì)胞內(nèi) 癌基因的表達(dá) 。例如，用 Rb基因轉(zhuǎn)染 NIH/3T3細(xì)胞可抑制 cfos癌基因在 G1晚期的表達(dá)。 Rb蛋白還可通過同 cmyc， Nmyc，erbB2／ neu等 癌基因產(chǎn)物 相結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì) 胞的增殖和分化。 2． P53基因 在過去十幾年里，人們對 p53基因的認(rèn)識經(jīng)歷了一個漫長的歷程 : 最初是通過在鼠類細(xì)胞中 p53蛋白與 DNA腫瘤病毒抗原的結(jié)合而發(fā)現(xiàn)的。 隨后克隆到了 p53基因，并證明它