【正文】 重組體或是它們的后代中篩選優(yōu)良菌種。這種育種方法稱為雜交育種。通過這種方法可以分離到具有新的基因組合的重組體，也可以選出由于具有雜種優(yōu)勢而生長旺盛、生物量多、適應(yīng)性強(qiáng)以及某些酶活性提高的新品系。雜交育種的方式因?qū)嶒?yàn)菌株的生殖方式不同而異，如有性雜交、準(zhǔn)性重組、原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化等；但是，選擇親株、分離群體后代的培養(yǎng)、擇優(yōu)去劣和雜種遺傳分析的過程基本是相同的。1雜交法：一般指有交配反應(yīng)的菌株進(jìn)行交配或接合而形成雜種。這種方法適用范圍很廣，在酒類、面包、藥用和飼料酵母的育種，鏈霉菌和青霉菌抗生素產(chǎn)量的提高，曲霉的酶活性增強(qiáng)等方面均已獲得成功。2原生質(zhì)體融合：是最近幾十年發(fā)展起來的基因重組技術(shù)，通過兩個(gè)遺傳性狀不同的親株原生質(zhì)體融合而達(dá)到雜交目的。此法在工業(yè)微生物的菌種改良中有積極作用，已成為工業(yè)微生物育種的重要手段。原生質(zhì)體融合育種技術(shù)原生質(zhì)體（Protoplast）：采用一定方法技術(shù)去掉細(xì)胞壁，剩下的細(xì)胞部分稱之為原生質(zhì)體。原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion）：用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體相互接觸、融合，經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交目的，經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子（fusant）。原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)點(diǎn)：雜交頻率較高 鏈霉菌通過原生質(zhì)體融合，后代的重組率達(dá)1%，比準(zhǔn)性重組率高2020000倍。擴(kuò)大重組的親本范圍 原生質(zhì)體由于完全或部分去除了細(xì)胞壁，能實(shí)現(xiàn)常規(guī)雜交無法做到的種間、屬間、門間等遠(yuǎn)緣雜交。提高菌株產(chǎn)量的潛力較大 原生質(zhì)體融合時(shí)親本整套染色體參與交換，遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親本優(yōu)良性狀機(jī)會(huì)更大。原生質(zhì)體融合育種步驟：1．標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證。2．原生質(zhì)體制備。3．等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗(yàn)證，挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn)、保藏。6．生產(chǎn)性能篩選。（五）基因工程育種：是指利用DNA重組技術(shù)將外源基因?qū)氲轿⑸锛?xì)胞，使后者獲得前者的某些優(yōu)良性狀或表達(dá)前者的基因產(chǎn)物而獲得新種。 基因工程育種的特點(diǎn)：q打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制 q可進(jìn)行定向變異和育種 q可創(chuàng)造出自然界中原本沒有的生物 基因工程育種的基本步驟： 目的基因的獲得選擇目的基因的途徑有4種：①選擇適宜的給體細(xì)胞,以便從中采集分離到有生產(chǎn)意義的目的基因；②通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成cDNA(互補(bǔ)DNA)；③通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段；④用化學(xué)方法合成特定功能的基因。選擇載體載體（Vector）是攜帶目的基因并將其轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的運(yùn)載工具。載體必須具備下列幾個(gè)條件:①是一個(gè)有自我復(fù)制能力的復(fù)制子。②能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，有較高的復(fù)制率；③最好只有一個(gè)限制性內(nèi)切酶的切口,使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上；④載體上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，如具有四環(huán)素、氨芐青霉素等的抗性基因,以便及時(shí)把極少數(shù)“工程菌”選擇出來。目的基因與載體連接獲得目的DNA片段和載體DNA片段后，要把兩者連接起來形成重組體。目的基因與載體DNA均采用限制性內(nèi)切酶處理，然后在DNA連接酶催化下，兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’磷酸和3’羥基間形成磷酸二酯鍵，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體。 在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA 連接酶。重組DNA分子導(dǎo)入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。轉(zhuǎn)化：指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。轉(zhuǎn)染和感染：利用噬菌體DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。陽性重組子的篩選、鑒定長出的菌落不一定都是含有正確目的DNA片段的陽性重組子，因此需要從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選、鑒定出含有陽性重組子的菌落。鑒定的方法有直接篩選法和分子生物學(xué)間接篩選法。前者利用可選擇的遺傳表型和功能如抗藥性、藍(lán)白斑、噬菌斑等可以直觀、快速的在大量群體中進(jìn)行篩選；后者根據(jù)目的基因的大小、核苷酸序列、基因表達(dá)產(chǎn)物的特性，用限制性酶切、分子雜交、核苷酸序列分析及表達(dá)產(chǎn)物分析。第3章 發(fā)酵工藝第一節(jié) 微生物發(fā)酵的一般流程發(fā)酵概念：利用微生物，在適宜的條件下，將原料經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過程?？諝饪諝鈨艋幚肀２鼐N斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)物分離純化成品滅菌發(fā)酵類別：v根據(jù)對氧的需要區(qū)分：厭氧和有氧發(fā)酵v根據(jù)培養(yǎng)基物理性狀區(qū)分：液體和固體發(fā)酵v根據(jù)微生物生長特性區(qū)分：分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵的一般流程 (1)用作培養(yǎng)菌種及擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制；(2)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌；(3)將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中；(4)將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產(chǎn)物；(5)將產(chǎn)物抽提并進(jìn)行提純，以得到合格的產(chǎn)品；(6)回收或處理發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢物和廢水。培養(yǎng)基的配制 ：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細(xì)胞生長、繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料。：216。滿足菌體的生長216。促進(jìn)產(chǎn)物的形成 （1）碳源作用：提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分；提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分。 來源：糖類、油脂、有機(jī)酸、正烷烴工業(yè)上常用的糖類：① 葡萄糖：所有的微生物都能利用葡萄糖，但是會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)； ② 糖蜜：糖蜜是制糖生產(chǎn)時(shí)的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的 副產(chǎn)物。 糖蜜使用的注意點(diǎn)：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會(huì)對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進(jìn)行預(yù)處理。 ③ 淀粉、糊精缺點(diǎn)：難利用；發(fā)酵液比較稠、一般%時(shí)加入一定的α淀粉酶；成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點(diǎn)：來源廣泛、價(jià)格底；難利用，可以解除葡萄糖效應(yīng)。注：不同碳源對微生物自身生長、發(fā)酵過程及產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生不同的影響。（2）氮源作用：氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。 無機(jī)氮源無機(jī)氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機(jī)氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機(jī)氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。有機(jī)氮源成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無機(jī)鹽及生長因子。氮源使用的一些相關(guān)問題：q有機(jī)氮源和無機(jī)氮源應(yīng)當(dāng)混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機(jī)氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)q有些產(chǎn)物會(huì)受氮源的誘導(dǎo)和阻遏q有機(jī)氮源選取時(shí)也要考慮微生物的同化能力q開發(fā)效果好、有針對性的有機(jī)氮源仍然是令人感興趣的課題（3）無機(jī)鹽的微量元素使用注意點(diǎn)：；B、使用時(shí)注意鹽的形式（pH的變化）（4）生長因子、前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑生長因子：凡是微生物生長不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。 前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。產(chǎn)物促進(jìn)劑：是指那些非細(xì)胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。 （5）水水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。 ① 培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟(jì)的合成。② 發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。③ 培養(yǎng)基的原料應(yīng)因地制宜，價(jià)格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購運(yùn)輸，適合大規(guī)模儲(chǔ)藏，能保證生產(chǎn)上的供應(yīng)。④ 所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足總體工藝的要求，如不應(yīng)該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。培養(yǎng)基與發(fā)酵設(shè)備的滅菌1雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。2污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。3培養(yǎng)基滅菌：是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。4滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子，%以上。消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物，達(dá)到無害化程度，%以上。 5滅菌的方法、原理（1）化學(xué)滅菌：用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作?；瘜W(xué)滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機(jī)化合物等。機(jī)理：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，細(xì)胞死亡。應(yīng)用：皮膚表面、器具、實(shí)驗(yàn)室和工廠的無菌區(qū)域的臺(tái)面、地面、墻壁及空間的滅菌。（2）物理滅菌：各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進(jìn)行滅菌。種類：紫外線等射線：局部空間 干熱滅菌：實(shí)驗(yàn)室器皿 蒸汽滅菌：培養(yǎng)基效果好，操作方便，廣泛使用。（3）蒸汽滅菌的原理：每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍。當(dāng)微生物處于最低溫度以下時(shí)，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡，加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進(jìn)行的。 致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時(shí)間愈短。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對熱阻：指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。微生物濃度與滅菌時(shí)間成正比，濃度越高，滅菌時(shí)間越長。培養(yǎng)基滅菌工藝 (1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實(shí)罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。特點(diǎn)：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡便，手動(dòng)。缺點(diǎn)：加熱和冷卻時(shí)間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。（2）連續(xù)滅菌操作：高溫短時(shí)滅菌操作，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。 加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。連續(xù)滅菌的特點(diǎn)1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少；2）熱能利用合理，易于自動(dòng)化控制3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對壓力要求高， MPa。空氣除菌工藝發(fā)酵對空氣的要求工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：利用空氣壓縮時(shí)所產(chǎn)