【正文】 蝦（Penaeus monodon）桿狀病毒（Penaeus monodontype baculovirus）病的現(xiàn)場(chǎng)診斷中，用1%%孔雀綠涂片作為初步的結(jié)果。這種方法是單一染色，制片的對(duì)比度差，分辨率低。黃捷等人（1995）篩選出兩種即可混合在一起，又能將對(duì)蝦肝胰涂片的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分別臺(tái)盼藍(lán)和伊紅Y（TE）。%%伊紅的混合染色液涂染肝胰腺細(xì)小病毒樣病毒感染的對(duì)蝦肝胰腺，觀察到核內(nèi)的病毒包含體。宋曉玲等（1996）的TE染色光鏡快速診斷，取死亡親蝦（Penaeus chinensis）胃上皮用TE染液進(jìn)行壓片染色，可觀察到細(xì)胞核內(nèi)空泡化，胞核腫大，即為陽(yáng)性發(fā)病。Lightner(1983)和Redman曾經(jīng)報(bào)道檢查草蝦是否感染桿狀病毒的簡(jiǎn)易方法，即直接用肝胰腺涂片，%的孔雀綠染色，若見(jiàn)明亮藍(lán)綠色的圓球形包含體即為陽(yáng)性。但孔雀綠對(duì)包含體并無(wú)特異性，包含體不容易與其他圓形物如脂滴或泌顆粒區(qū)分。Vickers 等(1993)報(bào)道了利用壓片涂抹對(duì)蝦的肝胰腺，分別用H－E染色和Y啶橙染色。都可以在不到1 h內(nèi)檢測(cè)出Penaeus monodontype baculovirus(MBV)包含體。經(jīng)Y啶橙染色的細(xì)胞利用熒光顯微鏡，可見(jiàn)黃綠色的桿狀病毒核內(nèi)包含體。Y啶橙對(duì)不同組合的蛋白質(zhì)有不同程度的結(jié)合性，細(xì)胞質(zhì)為紅色，脂滴為黑色，可避免孔雀染色的不準(zhǔn)確性。熒光顯微鏡也許是在光鏡水平對(duì)特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。暗場(chǎng)顯微鏡通過(guò)聚光之前的特殊裝置，使通過(guò)樣品進(jìn)入物鏡成像的光只有折射光或衍射光。這樣沒(méi)有樣品存在時(shí)視野是黑色的，而折射率很大的小顆粒觀察得很清晰。Momnoyama 等(1995)用暗場(chǎng)顯微鏡在日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）快速檢測(cè)到有Rodshaped nuclear virus of penaeus japonicus(RVPJ)。使用熒光顯微鏡和暗場(chǎng)顯微鏡這兩種方法，雖然觀察效果較好，但是對(duì)于一般蝦農(nóng)來(lái)說(shuō)是不切實(shí)際的。二）組織病理檢測(cè)（Light microscopy）光學(xué)顯微鏡技術(shù)曾經(jīng)在細(xì)胞學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用。不僅如此，在科學(xué)技術(shù)非常先進(jìn)的今天，仍然離不開(kāi)光學(xué)顯微鏡。用顯微鏡技術(shù)檢測(cè)對(duì)蝦病毒，就是利用各種不同染色方法將固定的蝦組織進(jìn)行切片后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察致病細(xì)胞病變的發(fā)育過(guò)程，病毒包含體的形成部位、形狀和大小，以及因感染W(wǎng)SSV而膨脹的細(xì)胞核。何建國(guó)等（1992）用常規(guī)的組織切片方法，經(jīng)HE染色在高倍鏡下鏡檢斑節(jié)對(duì)蝦WBV包含體，其仔蝦感染率為100%，%～100%。Lo 等(1997)用光學(xué)顯微鏡在斑節(jié)對(duì)蝦的眼柄、淋巴器官、中腸等組織中，觀察到被WSSV感染而腫大的細(xì)胞核。孫修勤和楠田理一（1996）用HE和Feulgen染色，在中國(guó)對(duì)蝦的肝胰腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了HPV包含體，其大小為22～24nm。Spann等（1995）用Feulgen染色，在來(lái)自澳大利亞的斑節(jié)對(duì)蝦的淋巴樣器官細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Lymphoid organ virus（LOV）病毒形成的胞質(zhì)含體。Bonami用Eosin染色，在范氏對(duì)蝦的淋巴器官中發(fā)現(xiàn)Lymphoid organ virus（LOVV）病毒形成的細(xì)胞質(zhì)包含體。宋曉玲等（1996）對(duì)死亡親蝦（Penaeus chinensis）用Davidson39。sAFA固定，按常規(guī)方法進(jìn)行光鏡制片，用Ehrlichi39。s酸性蘇木精染色。1%伊紅酒精（95%）溶液復(fù)染。在肝胰腺血竇觀察到血淋巴細(xì)胞核的皮下及造血組織壞死桿狀病毒（Hypodermal and Hematoopoietic Necrosis Baculorirus，HHNBV）病變。Brown和Brann39。s Gran染色可檢測(cè)到草蝦的MBV形成的核內(nèi)無(wú)定形包含體。Giemsa染色應(yīng)用于對(duì)蝦幼體中的HPV診斷可提高檢測(cè)的靈敏度（羅文新，1997）。三）電子顯微鏡（Elertron microscopy） 雖然光學(xué)顯微鏡仍然在組織病理學(xué)檢測(cè)中起著重要作用，但是光鏡的分辨率低，要研究?jī)?nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)和病毒粒子的大小、結(jié)構(gòu)和復(fù)制過(guò)程，需要分辨率更高的設(shè)備。Couch（1974）首次用電子顯微鏡在桃紅對(duì)蝦（Penaeusduorarum）體內(nèi)，觀察到一種對(duì)蝦桿狀病毒（Baculoviruspenaeid，Couch Bp），其大小為74nm270nm。何建國(guó)等（1996）%戊二醇固定液（，）固定具有白斑和紅體（不帶白斑）的斑節(jié)對(duì)蝦，組織略硬化后，解剖肝胰腺、甲殼下表皮及鰓。繼續(xù)在戊二醇固定液中固定。固定后的樣品經(jīng)磷酸緩沖液沖洗3次，每次30分鐘以上。經(jīng)丙銅酸系列脫水。Epon39。s812液滲透包埋，Epon39。s812液聚合條件為37℃，60℃過(guò)夜12小時(shí)以上。超薄切片在AO超薄機(jī)上進(jìn)行，切片厚度為50～100nm，切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙層染色之后在Philips CM10透射電鏡觀察。在鰓上皮細(xì)胞和甲殼表皮細(xì)胞感染三種類型桿狀病毒。Lightner和Redman（1993）在原糙對(duì)蝦（protrachypene precipuca）中發(fā)現(xiàn)一種虹彩病毒（Shrimp iridovirus，IRDO），為6角形，具單位膜構(gòu)成的囊膜。核酸蕊子直徑約85nm，為DNA型。病毒粒子直徑為122177。7nm，最寬處直徑為136177。nm。Boonyaratpalin 等（1993）在泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦中首次發(fā)現(xiàn)黃頭病毒（Yellow head virus，YHV），病毒粒子大小為150～20045～40nm，核衣殼為90～16016～22nm。何建國(guó)等（1995）在患白斑病的斑節(jié)對(duì)蝦鰓上皮細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)直徑約25nm的類微核糖核酸病毒（Picornaviruslike）。Lo 等（1997）在斑節(jié)對(duì)蝦的精巢中觀察有WSSV。陳細(xì)法等（1997）應(yīng)用超薄切片和負(fù)染等技術(shù)，在日本對(duì)蝦、長(zhǎng)毛對(duì)蝦（Penaeus penicillatus）和中國(guó)對(duì)蝦的腸、肝胰腺、淋巴樣器官、鰓和肌肉組織中，發(fā)現(xiàn)一種新桿狀病毒，稱之為淋巴樣細(xì)胞核型桿狀病毒（Lymphoid cell muclear baculovirus，LNBV）。病毒直徑96～112nm，是已知感染對(duì)蝦最大的一種病毒。中央是高電子密度的核心，外囊衣殼和囊膜，兩膜之間有寬闊的間隙。這9是已報(bào)道的任何一種對(duì)蝦桿狀病毒所沒(méi)有的。純化的病毒核殼衣表面有螺旋排列亞單位，也是該病毒特有的。張進(jìn)興等（1997）在中國(guó)對(duì)蝦的卵巢組織和受精卵細(xì)胞中，用電子顯微鏡觀察到有球狀病毒粒子。其大小為80nm左右。對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒是在中國(guó)對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)的第一種病毒（Lightner et al.，1985）。薛清剛等（1996）對(duì)該病毒進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。病毒顆粒呈20面立體對(duì)稱，～，屬細(xì)小病毒科?，F(xiàn)稱其為中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺細(xì)小病毒（Hepatopaneratic Parvovirus of Penaeus chinensis,HPVPC）。Wongteerasupara等(1995) 在患病的斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)SEMBV 病毒（a nonoccluded ,systemic baculovirus）,位于細(xì)胞核內(nèi)，無(wú)囊膜。有核衣的完整病毒粒子呈橢圓形，有突出的多絨毛狀附屬物，大小為276nm121nm。電子顯微鏡雖然可以觀察到病毒粒子，但是樣品制備困難，費(fèi)事較久，而且對(duì)于形態(tài)特征相似的病毒難以鑒別。所以，電鏡技術(shù)主要用于檢測(cè)病毒的有無(wú)及病毒類型的初步鑒定。而對(duì)于種和型鑒別必須借助于特異性更強(qiáng)的方法。四）免疫檢測(cè)技術(shù)（Immunoassay）免疫生物技術(shù)是利用特異性抗原抗體反應(yīng)來(lái)研究組織細(xì)胞特定抗原的定位和定量技術(shù)。由于無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，要對(duì)感染進(jìn)行免疫診斷，只能根據(jù)抗體對(duì)病原體的特異反應(yīng)。為了顯示和觀察這種抗原抗體反應(yīng)，需要預(yù)先將某種標(biāo)記物結(jié)合到抗體上。借標(biāo)記物的熒光或酶有色反應(yīng)、放射性或高電子密度，在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定位或定研究。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzymelinked immunosbent assay,ELISA）利用酶與底物反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或抗體的方法。Lewis等(1986)報(bào)道了用間接夾心ELISA法檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒。該方法可以檢測(cè)至少10納克的病毒蛋白。黃捷等（1995）用單克隆抗體酶聯(lián)免役技術(shù)檢測(cè)對(duì)蝦皮下造血組織壞死桿狀病毒（Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus,HHNBV）的病原體。這種方法快速簡(jiǎn)單，靈敏度高，且可定量。涂小林等（1995）用ELISA方法在中國(guó)對(duì)蝦的肝胰腺和鰓組織檢測(cè)了一種桿狀病毒。免疫熒光法（Immunofluorescence assay）是預(yù)先將熒光素標(biāo)記在抗體上，再與涂片、切片上或細(xì)胞懸液中的抗原進(jìn)行反應(yīng)。借助于熒光顯微鏡能夠觀察是否存在相應(yīng)的抗原并確定相應(yīng)的位置。陳秀男等（1988）用該方法來(lái)檢測(cè)草蝦肝胰腺和排泄物所存在的包含體。病毒包含體在熒光顯微鏡下綠色熒光或橙紅色。免疫熒光法需要特殊設(shè)備，不易作定量分析，而且對(duì)結(jié)果判定有一定的主觀性。相對(duì)地說(shuō)ELISA檢測(cè)的靈活性高，可達(dá)納可水平。且具有特易性強(qiáng)、簡(jiǎn)單、及易觀察等特點(diǎn)，可做定性定量分析，適合于對(duì)蝦病毒的早期診斷（羅文新，1997）。反向間接血凝實(shí)驗(yàn)（Reverse indirect hemagglutination，RIHA）是將特異性抗體與抗原連接到適當(dāng)處理過(guò)的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞表面。通過(guò)抗體與抗原之間的特異性結(jié)合反應(yīng)介導(dǎo)血細(xì)胞的凝結(jié)，從而達(dá)到檢測(cè)相應(yīng)抗原目的的一種簡(jiǎn)便免疫學(xué)診斷技術(shù)。薛清剛等（1995）用該方法檢測(cè)了中國(guó)對(duì)蝦的肝胰臟細(xì)小病毒HPV）。實(shí)驗(yàn)表明，該方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好， h內(nèi)完成，適合在現(xiàn)場(chǎng)推廣使用。五）對(duì)蝦組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（Tissue culture assay）雖然自Grace（1982）從鱗翅目昆蟲(chóng)Antherae eucalypti建立首株細(xì)胞后，昆蟲(chóng)的組織培養(yǎng)研究進(jìn)一步活躍起來(lái)。然而甲殼動(dòng)物的組織培養(yǎng)研究工作國(guó)內(nèi)外尚處于初期的實(shí)驗(yàn)性階段。Peponnet和Quiot（1971）首次報(bào)道了螯蝦、龍蝦和蟹的類淋巴組織的離體培養(yǎng)。Daig介紹了小龍蝦的上皮細(xì)胞培養(yǎng)。但這些實(shí)驗(yàn)僅限于原代組織細(xì)胞的培養(yǎng)。近10多年來(lái)，對(duì)蝦的組織研究工作進(jìn)展較快，取得了一定的成果（王立平等，1995；張曉華等，1995；Luedeman et ；Hsu et al.，1995）。Chen等（1986）首次報(bào)道了斑節(jié)對(duì)蝦卵巢、心臟、心肌、肌肉、神經(jīng)、腸道、肝胰腺和鰓等組織的體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)僅前兩種組織可生長(zhǎng)繁殖，并將卵巢組織細(xì)胞傳至第三代。Hsu 等（1995）對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦Oka器官（淋巴組織）組織細(xì)胞的各種培養(yǎng)條件進(jìn)行了全面地研究，并建立了世界上第一個(gè)對(duì)蝦細(xì)胞株。這是對(duì)蝦組織培養(yǎng)研究工作的一個(gè)重大突破。發(fā)展對(duì)蝦組織培養(yǎng)技術(shù)，不僅對(duì)深入研究對(duì)蝦病毒提供了方便，而且也為對(duì)蝦免疫學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞工程學(xué)等方面研究提供了有利條件。由于目前還沒(méi)有控制對(duì)蝦病毒病的有效藥物，可利用組織培養(yǎng)篩選抗病毒藥物。利用對(duì)蝦組織培養(yǎng)還可以制備病毒疫苗及為核酸探針檢測(cè)病毒提供條件。 六）CID50病毒滴定法（50% Tissue Culture Infectous Dose Assay）Lu等（1995）應(yīng)用T CID50來(lái)測(cè)定YBV的感染滴度，被感染組織為用96孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)的蝦淋巴器官細(xì)胞，測(cè)定YBV感染的蝦的鰓勻漿液，（）CID50/ml。這是首次報(bào)道的測(cè)定蝦病毒濃度的檢測(cè)手段。分子生物學(xué)技術(shù)極大地推動(dòng)了生物學(xué)科的發(fā)展。由于分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，分子生物學(xué)更加迅速?gòu)V泛地滲透到生命科學(xué)的各個(gè)學(xué)科。分子生物學(xué)技術(shù)具有高度的特異性和高度的靈敏性等特點(diǎn)，為對(duì)蝦病毒病的診斷和病毒的檢測(cè)提供了新的手段。七）聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）PCR是1983年由美國(guó)Mullis首先發(fā)現(xiàn)的。它是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，在模板DNA，引物（模板片段兩端的已知系列）和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，依靠TaqDNA聚合酶的催化，由高溫變性，低溫退火及適溫延伸三個(gè)步驟組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行使模板DNA得以擴(kuò)增。Erlich等（1988）和Ost（1988）就把PCR作為診斷病原體最有效的技術(shù)。Brock（1992）和Lightner等（1992）用PCR來(lái)檢測(cè)對(duì)蝦的有關(guān)病毒。Chang 等（1993）利用PCR 技術(shù)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒（MBV）純化和擴(kuò)增。這是首次成功地利用PCR技術(shù)進(jìn)行對(duì)蝦病毒的DNA擴(kuò)增。何建國(guó)等（1996）用PCR技術(shù)檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦的白斑綜合桿狀病毒（WSSV），并結(jié)合電鏡觀察證實(shí)紅體病斑節(jié)對(duì)蝦（不帶白斑者）不是WSSV所致。Kimura等（1996）用兩對(duì)PCR引物（P1/P2和P3/P4）檢測(cè)了日本對(duì)蝦的桿狀病毒（RVPJ）。套式PCR在蟹（Helice tridens）、昆蟲(chóng)（Ephydridae）和橈足類（Schmackeria dubia）檢測(cè)到有WSSV。楊豐等（1995）用PCR方法進(jìn)行所分離的斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒（MBV）包含體的鑒定，結(jié)果很理想。Wang等（1996）用PCR方法檢測(cè)對(duì)蝦中BP病毒，并獲得了預(yù)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物。郭福生等（1996）根據(jù)昆蟲(chóng)桿狀病毒多角體基因保守片段設(shè)計(jì)引物，用PCR對(duì)數(shù)百分養(yǎng)殖中國(guó)對(duì)蝦蝦卵、幼蝦、成蝦、5種海捕蝦與養(yǎng)殖有關(guān)的媒介餌料——橈足類、鉤蝦、藍(lán)蛤、小雜蟹、底泥等進(jìn)行了桿狀病毒檢測(cè)。八）原位雜交（In situ hybridization）原位雜交是利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知序列DNA和RNA探針，在細(xì)胞或染色體上與其互補(bǔ)的核酸序列配對(duì)雜交，再經(jīng)放射自顯影或免疫熒光、化學(xué)發(fā)光，在雜交原位上顯示雜交體的技術(shù)。Bruce等（1993）用原位雜交的技術(shù)檢測(cè)對(duì)蝦的桿狀病毒。Poulos等（1994）用非放射性標(biāo)記的DNA探針來(lái)檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦的桿狀病毒（MBV）。Mari等（1995）將HPV的DNA基因部分克隆，構(gòu)建2個(gè)不同的DigIIdUTP標(biāo)記的探針，進(jìn)行肝胰腺石蠟切片原位雜交，能與感染組織反應(yīng)。探針在細(xì)胞核中產(chǎn)生強(qiáng)烈標(biāo)記。嚴(yán)重感染的肝胰腺，細(xì)胞碎片與探針緊密結(jié)合，還可以在上皮細(xì)胞表面形成微小突起。Mari等（1993）抽提Infec