16s-rrna靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群-文庫吧
2025-07-20 07:48 本頁面
【正文】 和溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），而最新出現(xiàn)的是結(jié)合了DGGE和TGGE的主要原理的時間溫度梯度凝膠電泳。DGGE在微生物生態(tài)系統(tǒng)的首次應(yīng)用是在對海洋生態(tài)系統(tǒng)中的細菌多樣性分析（9）。凝膠電泳技術(shù)在快速比較不同環(huán)境中個微生物群落和檢測某一特定的群落在不同時間多個成員內(nèi)的組成變化的研究中非常有效。DGGE是一種利用序列差異來分離同樣長度DNA片段混合物的技術(shù)（10）。分離的原理是基于DNA片段在含有梯度變性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝膠澳中的序列特異性融點不同實現(xiàn)的，在5’端引入GC夾（GCClamp）可保護DNA片段不會完全變性。這個GC夾有30~50bp長，是在進行DGGE分析之前加到對靶基因進行PCR擴增的一個引物上的，理論上，在不長于500bp的PCR擴增產(chǎn)物上的單個堿基對差異都可以被鑒定出來，在變性梯度中，不同序列的片段將停留在不同的位置。2. 材料 利用試劑盒（Fast DNA SPIN Kit）分離DNAFast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）是商品話的DNA分離試劑盒，在實驗室中常用于廣泛的環(huán)境介質(zhì)檢測，包括土壤、沉積物、排泄物。也可用于其它DNA分離方法。 PCRPCR可以用Taq聚合酶在PCR儀上進行。不加模板DNA，先準備基本組分按照實驗室現(xiàn)有的試劑需要準備的基本組分就是Mix和上、下游引物及超純水。根據(jù)大多數(shù)文獻采用的量和濃度去加。：5μL10PCR緩沖液（10緩沖液：200mmol/L TrisHCl，500mmol/L KCl）3μL MgCl2（50 mmol/L）1μL上游引物（10 mmol/L）1μL下游引物（10 mmol/L） 1μLdNTP（10 mmol/L）（5U/μL）共49μL的反應(yīng)體積。配制時將上面的每一組份乘以需要的反應(yīng)次數(shù)，多加一份。（每管49μL）中，最后加入模板DNA（1μL）.每一反應(yīng)中最終模板的量在10~100ng之間。將離心管放入PCR儀中，開始按設(shè)定的反應(yīng)擴增。 DGGE DGGE儀器設(shè)備部分大小玻璃板Gelbond（膠貼）BioRad DGGE設(shè)備，包括：a．溫度控制模塊包括加熱器、攪拌器、泵和電泳導(dǎo)線。b．電泳槽c．三明治芯d．三明治夾e．分隔條f．梳子電源泵和混合槽 DGGE電泳變性劑（100%變性劑、0%變性劑）根據(jù)實驗要求選擇合適的變性劑濃度（一般為30%~60%），實驗所用試劑均用超純水進行配制，需過濾或滅菌的應(yīng)按照要求進行。有些藥品的保存期也是有限制的，盡量用新配制的溶液。試劑保證不能配錯。50TAE緩沖液：242gTris，。 DGGE染色溶液根據(jù)自己的選擇用染色液對凝膠進行染色。3. 方法
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