16s-rrna靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群-文庫吧在線文庫
【正文】 系統(tǒng)。，打開泵（流速為19mL/min），抽干系統(tǒng)?！叭髦巍狈旁谙鹉z密封墊上，并按下手柄。（見注釋6）。在擴(kuò)增過程中，PCR產(chǎn)物的5’或者3’端引入了GC夾，以避免完全變性，最終形成的叉狀結(jié)構(gòu)實質(zhì)上發(fā)揮了阻止遷移的作用。50TAE緩沖液：242gTris。：5μL10PCR緩沖液（10緩沖液：200mmol/L TrisHCl，500mmol/L KCl）3μL MgCl2（50 mmol/L）1μL上游引物（10 mmol/L）1μL下游引物（10 mmol/L） 1μLdNTP（10 mmol/L）（5U/μL）共49μL的反應(yīng)體積。DGGE是一種利用序列差異來分離同樣長度DNA片段混合物的技術(shù)（10）。這使得我們可以研究微生物群落并追蹤其在不斷變化的環(huán)境條件下的發(fā)展過程，所以包括歷史標(biāo)本，儲存的樣本（風(fēng)干保存用于后續(xù)分析的樣本）甚至考古樣本這些不可能用培養(yǎng)的方法獲得微生物的材料都可以得到研究（35）。我將這一章編寫的內(nèi)容全部敲下來給你，希望對你的實驗有所啟示和幫助。關(guān)鍵詞：食本芽孢桿菌（Bacillus benzoevorans）；DGGE；指紋圖譜；16S rRNA基因；土壤微生物1. 引言微生物菌群對于地球上甚至地球外的幾乎所有環(huán)境的發(fā)展和功能是至關(guān)重要的，而針對一系列細(xì)胞生物標(biāo)記物的分子微生物生態(tài)學(xué)方法的長足發(fā)展，使得對微生物群落組成和功能的檢測可以不依賴于微生物的培養(yǎng)（1，2）。最常用的是變性梯度凝膠電泳（DGGE）和溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），而最新出現(xiàn)的是結(jié)合了DGGE和TGGE的主要原理的時間溫度梯度凝膠電泳。 PCRPCR可以用Taq聚合酶在PCR儀上進(jìn)行。b．電泳槽c．三明治芯d．三明治夾e．分隔條f．梳子電源泵和混合槽 DGGE電泳變性劑（100%變性劑、0%變性劑）根據(jù)實驗要求選擇合適的變性劑濃度（一般為30%~60%），實驗所用試劑均用超純水進(jìn)行配制，需過濾或滅菌的應(yīng)按照要求進(jìn)行。DGGE的原理使利用序列特異性將同樣長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分開。 PCR程序下面是針對表1的引物優(yōu)化后的PCR循環(huán)參數(shù)，選擇專門對應(yīng)你處理的物種適合的程序。%乙醇清洗分隔條，并放于膠貼的左右兩側(cè)。4. “塞”溶液放置10min。，打開開關(guān)。避免氣泡產(chǎn)生，否則會在條帶中出現(xiàn)凹陷。，直至上緩沖室充滿緩沖液。 DGGE凝膠的統(tǒng)計分析DGGE凝膠經(jīng)過染色和過夜干燥后用400DPI分辨率掃描，（Applied Maths BVBA，比利時）進(jìn)行分析。5. 玻板的仔細(xì)清洗對凝膠配制非常關(guān)鍵，油脂點會導(dǎo)致聚丙烯酰胺凝膠表面扭曲。13. 步驟5~8的溶液按化學(xué)廢棄物處理。7. 避免出現(xiàn)氣泡。UPGMA算法可以在繪制聚類樹狀圖分析軟件中應(yīng)用。表2 DGGE梯度混合比例表梯度/%0%(mL)100
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