16s-rrna靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群(存儲版)
【正文】 常連到5’端。11. 按照Snaguinetti等（16）稍作修改。9. 將空的三明治放在盒架的另一邊，構(gòu)成一個封閉上緩沖室。4. 注釋1. 其他公司的聚合酶和PCR儀也可使用。，后打開Dcode。，輕輕拔出梳子。%APS到濃縮膠中?！叭?。染色后，可以在DNA分子在凝膠中停留遷移的位置觀察到條帶。 DGGE染色溶液根據(jù)自己的選擇用染色液對凝膠進(jìn)行染色。配制時將上面的每一組份乘以需要的反應(yīng)次數(shù)，多加一份。分離的原理是基于DNA片段在含有梯度變性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝膠澳中的序列特異性融點(diǎn)不同實(shí)現(xiàn)的，在5’端引入GC夾（GCClamp）可保護(hù)DNA片段不會完全變性。微生物生態(tài)學(xué)可以很方便的應(yīng)用核糖體RNA小亞基（SSU rRNA；細(xì)菌和古細(xì)菌的16S rRNA，真核生物的18S rRNA）和對應(yīng)的基因作為生物標(biāo)記物。第十七章16S rRNA靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群概論 過去幾十年中，利用所謂的生物標(biāo)記物來檢測環(huán)境樣本中的微生物菌群的分子微生物生態(tài)學(xué)（molecular microbial ecology）得到了快速的發(fā)展。DGGE能對微生物群落進(jìn)行快速的分析和比較，利用DGGE可使組成的多樣性一目了然，其中每一條帶原則上代表一種細(xì)菌系群，染色后，在凝膠中DNA分子停止遷移的位置會看到條帶，理論生，DGGE指紋圖譜可以區(qū)分一個堿基對的差別。幾種類型的梯度凝膠電泳已經(jīng)被有效地應(yīng)用于環(huán)境樣本中微生物群落的觀察。也可用于其它DNA分離方法。 DGGE DGGE儀器設(shè)備部分大小玻璃板Gelbond（膠貼）BioRad DGGE設(shè)備，包括：a．溫度控制模塊包括加熱器、攪拌器、泵和電泳導(dǎo)線。復(fù)雜的微生物群落可以利用DGGE達(dá)到可視化，理論上其中每一條帶代表一細(xì)菌種系型，然而，此技術(shù)的缺陷在于只利用了非常有限的遺傳信息（16S rRNA）。這種試劑盒可高效裂解所有的微生物，包括原來比較難處理的如細(xì)菌芽孢和內(nèi)孢子、革蘭氏陽性細(xì)菌、酵母、藻類、線蟲和真菌。2. 如下制備“塞”溶液（一塊凝膠體積）： 0%變性劑，8%PAG溶液 TEMED15μL 10%APS3. 通過橡膠密封墊一邊加入1mL“塞”溶液（見注釋7）。，在左室加入低濃度溶液。，插入梳子，讓其凝固形成加樣孔。“三明治”，放入電泳槽中。，放入托盤中進(jìn)行染色觀察和干燥。4. 注意：在DGGE凝膠的電泳和顯影過程中所用的是高毒和致癌物質(zhì)，使用時，請 佩戴手套，而且當(dāng)被污染時，及時更換。12. 凝膠也可以用SYBR GOLD或EB及其他染液染色。8. 使用通風(fēng)柜。多變量數(shù)據(jù)分析（如CANOCO軟件）也可用于DGGE圖譜分析，關(guān)于其他用于分析微生物群落指紋圖譜的數(shù)據(jù)分析方法在Fromin等的文章中有所討論。（見注釋10）。，以便緩沖液在60達(dá)到平衡。，啟動泵抽干
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