16s-rrna靶向變性梯度凝膠電泳指紋圖譜分析微生物菌群-免費(fèi)閱讀
【正文】 10. 記住上樣是按照鏡面方向。2. ，其他染色無需加入。，200V電泳10min，調(diào)至85V再電泳16h。，并輕敲“三明治”。，在右室加入濃縮膠。 凝膠“塞”制備在制備主要的分析梯度凝膠前，需在DGGE玻板盒底部做一個(gè)0%變性劑PAG凝膠“塞”——防治底部泄露。（你可以滴一滴水在膠貼上來方便地檢查疏水面，疏水面的水將滑落）。理論上，DGGE指紋圖譜可以區(qū)分單個(gè)堿基對(duì)的差異。3. 方法DGGE是在分子微生物生態(tài)學(xué)中建立的較完善的分子指紋圖譜技術(shù)（11,12）。（每管49μL）中，最后加入模板DNA（1μL）.每一反應(yīng)中最終模板的量在10~100ng之間。這個(gè)GC夾有30~50bp長，是在進(jìn)行DGGE分析之前加到對(duì)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的一個(gè)引物上的，理論上，在不長于500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上的單個(gè)堿基對(duì)差異都可以被鑒定出來，在變性梯度中，不同序列的片段將停留在不同的位置。以這些分子作為靶點(diǎn)，可以利用很多互為補(bǔ)充的分子技術(shù)來檢測不同環(huán)境下總的細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物群落，以及特定的感興趣的微生物種類。許多分子可以作為生物標(biāo)記物，包括細(xì)胞壁成分、蛋白質(zhì)、脂類、DNA或RNA，尤其是核糖體RNA（rRNA）小亞基和相應(yīng)基因的應(yīng)用在微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。目前已經(jīng)建立了幾種應(yīng)用于環(huán)境樣本中的微生物群落的指紋特征分析方法，其中最常用的方法是PCR擴(kuò)增片段的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），DGGE可以根據(jù)序列將相同長度的DNA片段混合物分開，分離的原理使基于DNA片段在含有梯度變性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝膠中的序列特異性融點(diǎn)不同實(shí)現(xiàn)的。多以SSU rRNA基因檢測作為普遍的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記物的分子指紋圖譜方法，常被用于在分子微生物生態(tài)學(xué)中快速檢測不同時(shí)間或空間中微生物群落組分的變化，結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，這些技術(shù)是研究不斷變化的環(huán)境因子如何影響微生物群落構(gòu)成的有力工具（6,7）。2. 材料 利用試劑盒（Fast DNA SPIN Kit）分離DNAFast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）是商品話的DNA分離試劑盒，在實(shí)驗(yàn)室中常用于廣泛的環(huán)境介質(zhì)檢測，包括土壤、沉積物、排泄物。將離心管放入PCR儀中，開始按設(shè)定的反應(yīng)擴(kuò)增。DGGE技術(shù)可以迅速地分析微生物群落。 DNA分離DNA可用Fast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）直接從土壤中（或其他樣本）按照說明書進(jìn)行分離。制備凝膠“塞”的主要方法如下：1. 確保凝膠架處于水平；必要時(shí)調(diào)節(jié)底部的螺絲。，加入10%APS至高濃度和低濃度的變性劑溶液。，啟動(dòng)泵，保持流速為3 mL/min。，打開蓋子。 凝膠染色（見注釋11和12）。3. GC夾可以連到上游和下游引物，但是通
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