【正文】 中還應(yīng)用于廢紙脫墨這一重要環(huán)節(jié)，不僅使脫墨工藝變得容易，而且減少了化學(xué)藥品的用量。木聚糖酶應(yīng)用于紙漿生物漂白工藝過程，減少了氯氣用量，減少致癌物質(zhì)的排放，減輕環(huán)境污染，顯著改善了紙漿的濾過性、脆性，增加了纖維的分離度、紙漿漂白度，降低了生產(chǎn)能耗，降低了生產(chǎn)成本，其諸多優(yōu)點(diǎn)不斷在造紙工業(yè)中顯現(xiàn)出來。在食品行業(yè)中的應(yīng)用：木聚糖酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在將天然半纖維素分解后得到低聚木糖這一環(huán)節(jié)。在面包的生產(chǎn)中，1/3的水分是面團(tuán)中的戊聚糖吸收的，戊聚糖的高吸水性對面團(tuán)和面包的質(zhì)量有明顯的影響。在新鮮蔬菜、水果加工成嬰兒食品、膏狀物、干燥蔬菜粉末和速溶食品時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)通常被一層堅(jiān)硬的半纖維素、果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁所包圍，如果對其用含有纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶的酶制劑來處理，就可在比較溫和條件下使組織柔化，使細(xì)胞破壁，將有效物質(zhì)充分提取出來。與此同時(shí)也降低了提取液的粘度，使生產(chǎn)過程中的濃縮、干燥效率成倍提高，相應(yīng)降低生產(chǎn)成本。其他應(yīng)用：據(jù)報(bào)道，木聚糖酶可與其它酶共同參與使植物降解為戊糖、己糖，再用其它菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)能把植物纖維直接轉(zhuǎn)化為乙醇的一些菌，如Thermbacteroides acetoethylicus, Clotridium thermosaccharolyticum。另據(jù)報(bào)道，木聚糖酶在去污洗滌，醫(yī)藥制造，以及在果實(shí)成熟、種子萌發(fā)、真菌的寄生及植物的抗性等諸多生理過程中都有著重要的應(yīng)用。我國對木聚糖酶的研究主要集中在產(chǎn)木聚糖酶優(yōu)良菌株的篩選和馴化、木聚糖酶的純化和理化性質(zhì)的研究等方面。當(dāng)前，木聚糖酶主要通過真菌、細(xì)菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得。根據(jù)發(fā)酵工藝的不同，可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種。這兩種發(fā)酵方式各有其優(yōu)缺點(diǎn)：固體發(fā)酵所用培養(yǎng)基相對便宜，主要以農(nóng)副產(chǎn)品為主。且操作設(shè)備簡單，整個(gè)生產(chǎn)過程中無廢物產(chǎn)生，不存在環(huán)境污染問題，產(chǎn)率較高。易于在中、小企業(yè)推廣應(yīng)用，目前國內(nèi)木聚糖酶生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵方式。但固體發(fā)酵同時(shí)也存在不易控制，酶系復(fù)雜，纖維素等酶含量高，難以精酶化等缺點(diǎn)；相比較而言，液體發(fā)酵由于是在液態(tài)環(huán)境中進(jìn)行，菌體、底物、產(chǎn)物（包括熱）均易于擴(kuò)散，使得發(fā)酵能夠在均質(zhì)或擬均質(zhì)條件下進(jìn)行。該方法便于在生產(chǎn)過程中進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測、控制，易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。同時(shí)，由于液體輸送方便，便于機(jī)械化操作，產(chǎn)品也易于提取精制。液態(tài)發(fā)酵工藝的缺點(diǎn)主要是對設(shè)備有一定要求及生產(chǎn)成本較高，技術(shù)要求也較為嚴(yán)格。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展和木聚糖酶廣泛應(yīng)用，采用液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶將成為今后發(fā)展方向。與國外相比，國內(nèi)在木聚糖酶方面的研究起步較晚，主要集中于海棗曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽孢桿菌、串珠鏈孢菌、鏈霉菌、環(huán)狀芽孢桿菌、堿性假單胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究。目前為止，國內(nèi)學(xué)者報(bào)道對木聚糖酶的研究基本上還僅限于對產(chǎn)木聚糖酶天然優(yōu)良菌株的篩選、酶的純化和一些酶學(xué)性質(zhì)研究方面，只克隆了少數(shù)木聚糖酶基因[27]。由于木聚糖酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值以及在生物工程技術(shù)的重要地位，現(xiàn)在己經(jīng)有越來越多的科研人員致力于木聚糖酶的開發(fā)研究，如高產(chǎn)菌株的選育、工程菌的構(gòu)建、優(yōu)化培養(yǎng)條件、無纖維素酶污染的木聚糖酶等。 巴斯德畢赤酵母屬子囊菌類,為單倍體,由于在其細(xì)胞的過氧化物酶體中含有甲醇代謝途徑所必需的酶,如醇氧化酶(alcohol oxidase ,AOX) 、過氧化氫酶、二羥丙酮合成酶等 ,所以可利用甲醇作為唯一碳源和能源。由于巴斯德畢赤酵母能夠在簡單培養(yǎng)基上高密度發(fā)酵生長,所以它最初是作為一種工業(yè)的甲醇營養(yǎng)型酵母,主要用來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)。 經(jīng)過二十多年的研究和應(yīng)用發(fā)現(xiàn),巴斯德畢赤酵母具有以下主要優(yōu)點(diǎn):(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一； (2)表達(dá)效率高,其表達(dá)的外源蛋白可占總表達(dá)蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分離純化； (3)在簡單合成培養(yǎng)基中可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)； (4)表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合； (5)由于該酵母可以以甲醇為唯一碳源和能源,而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源,可以減少污染。它也具有以下缺點(diǎn):(1)發(fā)酵周期長 (2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危險(xiǎn)性 (3)篩選高產(chǎn)菌株需用的藥物價(jià)格比較昂貴 (4)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不成熟巴斯德畢赤酵母是單細(xì)胞低等真核生物, 它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性, 同時(shí)又具有適于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng), 還能分泌外源蛋白到培養(yǎng)液中, 利于純化。近幾十年來, 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展成為一個(gè)較為理想的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。它具有外源目的蛋白表達(dá)量高、基因遺傳穩(wěn)定和分泌效率高等優(yōu)點(diǎn), 并具有甲醇精確調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子—醇氧化酶啟動(dòng)子( PAOX )及日臻成熟的高密度發(fā)酵工藝, 是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一, 越來越受到人們的重視, 被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于大量生產(chǎn)外源真核或其他結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原核蛋白。目前, 已經(jīng)有500多種外源蛋白在該系統(tǒng)中進(jìn)行了高效表達(dá)。 第二章 木聚糖酶發(fā)酵機(jī)理 相對而言，對畢氏酵母的報(bào)道比較少且多為非結(jié)構(gòu)模型。由于非結(jié)構(gòu)模型多采用經(jīng)驗(yàn)的 Monod 模型描述菌體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，在表達(dá)菌體干重濃度和蛋白方面精度較差?？紤]到面包酵母和畢氏酵母在代謝行為和菌體形態(tài)多方面有很大的相似性，因此面包酵母的很多研究成果可以為畢氏酵母所借鑒。本章以 Bellgardt（1983）建立的面包酵母動(dòng)力學(xué)模型為基礎(chǔ)，借鑒文獻(xiàn)所報(bào)道的甘油和甲醇的代謝途徑，對畢氏酵母發(fā)酵動(dòng)力學(xué)建模。甘油的主要代謝途徑包括磷酸化、糖酵解、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈。在甲醇期，甲醇首先被氧化為甲醛，甲醛隨后進(jìn)入分解代謝與合成代謝兩個(gè)途徑。在分解代謝中，甲醛被氧化為甲酸鹽和二氧化碳，并以電子NADH的形式釋放能量。合成代謝途徑與甘油期類似，也包括磷酸化、糖酵解和三羧酸循環(huán)等過程。 細(xì)胞外的甘油進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，首先被甘油激酶磷酸化為三磷酸甘油 G3P（Glycerol3phosphate）。G3P 在三磷酸甘油脫氫酶的作用下被氧化為磷酸二羥丙酮。經(jīng)過糖酵解過程，磷酸二羥丙酮被分解成丙酮酸（PYR）。丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下被氧化為乙酰輔酶 A（AcetylCoA）。通常在沒有任何反應(yīng)限制下，乙酰輔酶 A 直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCAcycle），在此過程中會(huì)有大量細(xì)胞物質(zhì)合成（如氨基酸、核酸等），同時(shí)伴隨電子載體（NADH）和能量（ATP）的轉(zhuǎn)換。在代謝過程中，如果溶氧或者丙酮酸脫羧反應(yīng)速率受到限制，代謝將會(huì)進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑。此時(shí)，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙醛（Acetaldehyde），乙醛在醇脫氫酶的作用下生成乙醇。而當(dāng)上述限制解除后，乙醇又可作為基質(zhì)被利用，這時(shí)，乙醇首先被氧化為乙醛，乙醛進(jìn)而被氧化為乙酸鹽，最后轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A 進(jìn)入 TCA 循環(huán)。伴隨著甘油的代謝途徑，也有呼吸鏈的作用。呼吸鏈的主要作用是為細(xì)胞的生長和維持提供能量。關(guān)于甘油期內(nèi)細(xì)胞的合成代謝，在此假定細(xì)胞物質(zhì)小部分由 G3P 轉(zhuǎn)化生成，其余大部分在 TCA 循環(huán)中生成。乙醇的生成和消耗過程見圖 中的點(diǎn)框，三羧酸循環(huán)和呼吸鏈分別見圖 中的虛線框。圖 給出了簡化的甘油在畢氏酵母細(xì)胞內(nèi)部代謝途徑。 其中甘油轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油： （21）G3P 的糖酵解方程（22）以及G3P 合成細(xì)胞物質(zhì)的方程（23）如下： （22） （23）視發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平或者丙酮酸脫羧反應(yīng)速率是否受到限制，丙酮酸可能直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)或者進(jìn)入乙醇發(fā)酵支鏈。在我們的實(shí)驗(yàn)中，溶氧濃度一直保持在 30％以上，所以溶氧不受限；同時(shí)實(shí)時(shí)測量表明發(fā)酵罐內(nèi)乙醇濃度在 0～ g l1較低的范圍內(nèi)，為此出于模型的簡化，本文忽略乙醇的發(fā)酵途徑，認(rèn)為丙酮酸直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)： （24） （25） (26)其中（25）是 TCA 循環(huán)的簡化方程，（26）描述了三羧酸循環(huán)過程中細(xì)胞物質(zhì)的生成。呼吸鏈中提供大量的能量轉(zhuǎn)換，見下式： （27）甘油代謝過程中產(chǎn)生的 ATP 一部分用于細(xì)胞生長過程的能量消耗，另一部分用于細(xì)胞自身生命的維持，甘油代謝過程中，細(xì)胞物質(zhì)主要在 G3P 糖酵解過程和三羧酸循環(huán)中合成。圖 是簡化的甲醇期甲醇的代謝途徑，甲醇首先被醇氧化酶（AOX）氧化成甲醛和過氧化氫。甲醛隨后進(jìn)入兩條代謝途徑，小部分進(jìn)入分解代謝，大部分進(jìn)入合成代謝。在分解代謝中，甲醛首先被甲醛脫氫酶（FLD1p）氧化為甲酸鹽，并進(jìn)一步被甲酸鹽脫氫酶（FDH）氧化為二氧化碳，同時(shí)以電子 NADH 的形式釋放能量，同時(shí)也避免了細(xì)胞內(nèi)部甲醇積累過多而產(chǎn)生毒害作用（Sibirny et al., 1990）。在合成代謝中，甲醛在二羥基丙酮合成酶的作用下與 5 磷木棉糖結(jié)合生成三磷酸甘油醛（GAP），GAP 隨后進(jìn)入糖酵解和 TCA 循環(huán)。本文假定甲醇期的細(xì)胞物質(zhì)主要從 GAP 和 TCA 循環(huán)中轉(zhuǎn)化合成。消耗的甲醇進(jìn)入分解代謝的比例為 φ。對于 φ 的大小，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不一。Veenhuis et al.（1983）認(rèn)為，甲醇代謝過程所需的能量主要來自分解代謝，因此進(jìn)入分解代謝途徑的甲醛較多；而 Sibirny et al.（1990）認(rèn)為，分解代謝的作用主要是保護(hù)細(xì)胞不因大量的甲醇?xì)埩舳卸镜?，代謝過程中需要的能量主要來自合成代謝，故進(jìn)入合成代謝途徑的甲醛較多。由于碳源主要是在合成代謝途徑中消耗的，大量的能量應(yīng)來自于合成代謝。在本文的實(shí)驗(yàn)中，甲醇期比生長速率的控制在較低水平（ h1），甲醇的殘留濃度幾乎為零，因此不需要進(jìn)行過多的分解代謝以避免較高濃度的甲醇?xì)埩?，故此本文?。不可否認(rèn)，φ 的取值未必精確，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來修正。幸運(yùn)地是，φ 引起的誤差可以由模型中的其它參數(shù)來彌補(bǔ)。 畢赤酵母甲醇代謝途徑在此可以列出甲醇期的化學(xué)計(jì)量平衡方程：甲醇首先被氧化為甲醛： （28）甲醛在分解代謝中被氧化為甲酸欲，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槎趸迹? (29)甲醛在合成代謝過程中被磷酸化。擊要指出的是，生成1摩爾的GAP擊要消耗3摩爾的甲醛(Lin Cereghino and Cregg, 2000: Lueers et al., 1998)。 （210）GAP酵解生成內(nèi)酮酸以及合成細(xì)胞物質(zhì)的方程分別見下式： （211） （212）內(nèi)酮酸被氧化為乙酞輔酶A甲醇期乙酞輔酶A以后的代謝途徑以及呼吸鏈中的代謝途徑與甘油期相同，前面有所介紹，這不過多重復(fù)，主要反應(yīng)有： （24） （25） (26)同前所述。 甘油是菌體生長階段普遍采用的碳源,通過補(bǔ)料加入培養(yǎng)基,其濃度過低或過高會(huì)限制或抑制菌體生長,因此,需要優(yōu)化初始甘油濃度,選擇有效的補(bǔ)料方式。葡萄糖也可作為碳源,雖效果不如甘油,但性價(jià)比卻優(yōu)于甘油, 以葡萄糖代替甘油將有利于工業(yè)化生產(chǎn)。甲醇是誘導(dǎo)表達(dá)階段的碳源,其濃度(CMeOH )和補(bǔ)料方式是關(guān)鍵。CMeOH過低,會(huì)限制菌體生長和誘導(dǎo)強(qiáng)度。 CMeOH過高,則對菌體產(chǎn)生毒性。甲醇最佳濃度一般在0. 5% ～3% ( v/v) ,但有些蛋白高于3%],因此,不同蛋白的最佳濃度不同,需通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合補(bǔ)料策略確定。CMeOH通過補(bǔ)料調(diào)節(jié)并保持恒定,其檢測控制方法有溶氧反饋控制、甲醇離線控制和在線控制,而甲醇在線控制最優(yōu)。　　氨水常作為氮源,并用于調(diào)節(jié)pH,其釋放的NH4濃度對菌體生長、蛋白表達(dá)和降解有重要影響。濃度過低,限制菌體生長,并增加蛋白的降解。濃度過高,雖可減少蛋白降解,卻會(huì)抑制菌體生長和蛋白表達(dá)。因此, NH4+濃度需要優(yōu)化,并采用恒濃度或變濃度法調(diào)控。謝靜莉等在發(fā)酵后期添加(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+濃度維持在150mmol/L以上,蛋白表達(dá)量提高58. 8%。采用變濃度法調(diào)控NH4+濃度后,既促進(jìn)菌體生長,提高表達(dá)量,又降低蛋白酶降解?！　≡诒磉_(dá)分泌蛋白時(shí),需降低基礎(chǔ)鹽濃度?；A(chǔ)鹽。濃度過高,會(huì)導(dǎo)致菌體死亡,并增加蛋白酶釋放,增加蛋白降解。Surribas等以電導(dǎo)率反映基礎(chǔ)鹽濃度,將初始電導(dǎo)率降為30% ,并在誘導(dǎo)過程維持在20%后,菌體死亡率下降。Zhao等將基礎(chǔ)鹽濃度降為1 /4時(shí),誘導(dǎo)前后菌體死亡率分別降低83. 3%和48. 6% ～59. 2% ,菌體密度增加25% , HAS2IFN2α2b表達(dá)量提高92. 0% ,并保持恒定。PTM1 微量鹽溶液成分過于復(fù)雜,不能高溫滅菌,易形成沉淀且價(jià)格較高,不利于大規(guī)模發(fā)酵,可用低濃度的酵母抽提物來替代PTM1 微量鹽,簡化工藝,也可用麥芽汁來替代,性價(jià)比可大幅提高,即簡化工藝又降低成本,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。,降低蛋白酶降解在培養(yǎng)基中添加VitC、VitE可以減少菌體死亡,減少蛋白酶的分泌。添加蛋白胨或酪蛋白水解物等底物,競爭性抑制蛋白酶活性。添加蛋白酶抑制劑或EDTA,抑制蛋白酶活性, 它們都能降低蛋白酶降解。Xiao等[添加VitC并維持在4～10mmol /L后,菌體死亡率降低65. 4% ,水蛭素降解程度降低30. 2% ,完整蛋白的表達(dá)量提高56. 8%。Zhao等在誘導(dǎo)前添加2%大豆胨后, HAS2IFN2