【正文】 后實施。當(dāng)驗證方案確定后，就要編制一份驗證計劃書。驗證方案書的內(nèi)容必須包括對驗證對象（如設(shè)備、工藝過程、檢測方法等）用流程式文字作簡單明了的描述，一般的驗證方案書可按下列內(nèi)容和要求進(jìn)行編寫：1) 驗證項目名稱；2) 驗證目的；3) 驗證小組的構(gòu)成；4) 驗證依據(jù)；5) 驗證項目；6) 驗證條件；7) 驗證方法；8) 確認(rèn)出證；9) 結(jié)果評價。八、驗證的實施 在驗證計劃經(jīng)過各方協(xié)商后，應(yīng)按照計劃的規(guī)定去做好準(zhǔn)備工作，首先，要檢查一下實施驗證的一些必需條件，資源是否具備，例如各種標(biāo)準(zhǔn)器、檢驗化驗儀器、試劑、記錄儀器、測量儀器等等。這些工具都必須在驗證前準(zhǔn)備完善。另外，驗證過程中所需要的各種記錄表格，也應(yīng)準(zhǔn)備完畢，不得隨意代用。在驗證方案實施前，還應(yīng)對所有使用的儀器儀表進(jìn)行校準(zhǔn)檢定，以確保驗證的數(shù)據(jù)正確無誤。在驗證實施過程中所有參加驗證工作的人員，必須要對驗證方案進(jìn)行認(rèn)真的學(xué)習(xí)，掌握了解所規(guī)定的驗證方法和要求，及有關(guān)的參數(shù)引用文件的規(guī)定。嚴(yán)格按驗證方案的規(guī)定去進(jìn)行操作，檢查并記錄各種運行狀態(tài)，確認(rèn)有關(guān)數(shù)據(jù)。若可能會出現(xiàn)對驗證方案進(jìn)行補充和修改的情況，可以另外起草一份補充方案，并說明修改或補充的內(nèi)容和理由，待整個驗證工作結(jié)束后，再重新改寫。補充方案應(yīng)經(jīng)原方案批準(zhǔn)人審批。九、驗證結(jié)果的審批 驗證工作結(jié)束以后，驗證人員應(yīng)將驗證結(jié)果整理匯總，形成一份驗證試驗報告。在準(zhǔn)備驗證報告時，可按照驗證方案的內(nèi)容和項目進(jìn)行描述，評價驗證最終結(jié)果是否符合設(shè)定的工藝參數(shù)或標(biāo)準(zhǔn)，對偏離或不符合規(guī)定的結(jié)果應(yīng)予以說明，必要時可重新進(jìn)行驗證。驗證報告應(yīng)包括或參照以下內(nèi)容：1) 滅菌產(chǎn)品的說明（包括、包裝、滅菌柜內(nèi)的裝載圖）；2) 滅菌器的技術(shù)條件；3) 設(shè)施驗證數(shù)據(jù)；4) 所有性能的物理記錄和生物記錄；5) 所有儀表記錄儀等在進(jìn)行性能驗證時的校準(zhǔn)說明；6) 復(fù)審和重新驗證的方案（如需要）；7) 驗證方案；8) 所用程序的文件資料；9) 所有人員的培訓(xùn)記錄與證書（復(fù)印件）；10) 文件化操作規(guī)程，包括過程界限；11) 程序維持與校核。驗證報告在獲得最終批準(zhǔn)之前，所有參加驗證方案會簽的人員應(yīng)對其內(nèi)容進(jìn)行審核確認(rèn)，授權(quán)人正式簽字批準(zhǔn)后，形成正式文件，并將驗證結(jié)果通報有關(guān)職能部門，作為制定工藝文件或作業(yè)指導(dǎo)書的一個重要依據(jù)。驗證結(jié)束后，有關(guān)的資料應(yīng)由職能部門負(fù)責(zé)整理歸檔，便于今后的驗證工作或新的項目實施驗證時參考。驗證文件、資料的保管按性質(zhì)可分為兩大類：廠房、設(shè)備性的驗證資料應(yīng)作為長期保存，生產(chǎn)過程工藝性的驗證資料可根據(jù)企業(yè)情況制訂保存期限。第二章 環(huán)氧乙烷滅菌驗證基本概念一．微生物微生物是存在于自然界中的一群形體微小、構(gòu)造簡單、肉眼直接看不見，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大幾百倍、幾千倍、甚至幾萬倍才能觀察到的低等生物。微生物一般由單細(xì)胞構(gòu)成也有簡單的多細(xì)胞，具有一定的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能，并能在適宜的環(huán)境中快速地生長和繁殖。微生物的種類繁多，至少十萬種以上，:非細(xì)胞型微生物：體積微小,能通過濾菌器,只能在活細(xì)胞內(nèi)生長繁殖。病毒屬此類。原核細(xì)胞型微生物：僅有原始核，無核仁和核膜，缺乏完整的細(xì)胞器。如：細(xì)菌衣原體，支原體，螺旋體和放線菌。真核細(xì)胞型微生物：細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，胞漿內(nèi)有完整的細(xì)胞器。真菌屬此類。由于病毒、細(xì)菌、真菌等形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理活動、代謝產(chǎn)物等不盡相同，它們又可各自進(jìn)一步分類。必須指出，細(xì)菌形態(tài)保證在分類中僅僅是初步的鑒定依據(jù)，一般需按其生理特征，抗原構(gòu)造和DNA鹼基組成等鑒定。二、細(xì)菌細(xì)菌是一類具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞微生物。細(xì)菌形態(tài)微小、結(jié)構(gòu)簡單，無典型的細(xì)胞核，只有核質(zhì)（染色體），無核膜和核仁，不進(jìn)行有絲分裂，除核蛋白體外無其他細(xì)胞器。細(xì)菌在一定環(huán)境下有相對恒定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與其生理功能、致病、免疫等特性有關(guān)。細(xì)菌個體很小須用顯微鏡放大數(shù)百倍才能看見。一般以微米（1μm=1/1000 mm）作為測量其大小的單位，不同種類的細(xì)菌大小不一，同一種細(xì)菌也可受菌齡和環(huán)境因素的影響，其大小有所差異。細(xì)菌的外形有球形、桿形、螺形三種基本形態(tài)，分別稱為球菌、桿菌和螺旋菌。三、產(chǎn)品初始污染菌要求指滅菌前，附著在包裝材料和醫(yī)療用品上的全部活的微生物之和。滅菌產(chǎn)品管道類內(nèi)腔≤10 cfu /件次，外部≤100 cfu /件次；非管道類≤100 cfu /件次；敷料類≤100 cfu /g；消毒產(chǎn)品≤1000 cfu /件次或重量（g）。應(yīng)當(dāng)指出，初始污染菌是產(chǎn)品從原料、加工、外協(xié)件、組裝、過程檢驗、車間與員工衛(wèi)生狀況、傳遞、包裝等環(huán)節(jié)中被污染的，它提供微生物污染信息，了解微生物污染水平，有利于分析污染微生物分類，用以提高產(chǎn)品安全衛(wèi)生水平。初始污染菌的檢驗是方法結(jié)果，沒有一個方法能檢出產(chǎn)品存活全部微生物。二種檢測方法比較項 目GB15980EN 11741洗滌劑培養(yǎng)基校正因子無菌生理藍(lán)水營養(yǎng)瓊脂無含蛋白胨，表面活性劑胰酪大豆瓊脂有初始污染菌的檢測，滅菌產(chǎn)品分別檢驗管道內(nèi)腔與外部染菌數(shù)。對一次性使用醫(yī)療器具如輸液器、輸血器、注射器等，檢驗管道內(nèi)初始污染菌尤為重要。附：GB159801995 《一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄C：初始污染菌數(shù)檢測：C1采樣方法C1．1 對可用破壞性方法取樣的醫(yī)療用品，如輸液（血）器、注射器、注射針、透析器及各類導(dǎo)管等，按中華人民共和國藥典（1990年版）規(guī)定執(zhí)行。C1．2 對不能用破壞性方法取樣的特殊醫(yī)療用品可用浸有生理鹽水的棉拭子涂抹采樣，被采表面100cm2取全部表面；被采表面≥100cm2取100cm2。C1．3 敷料類可用無菌手續(xù)取10g，放入100mL生理鹽水中，充分振蕩后取樣。 采樣數(shù)量：各類產(chǎn)品每批隨機抽取10件樣品。C2 檢驗方法和結(jié)果計算將每樣取5份平行樣， 《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢查方法》規(guī)定執(zhí)行。計算公式為： 平均菌數(shù)*稀釋倍數(shù) 菌數(shù)/每件次（或g）= ————————— 件次或重量（g）四、消毒用物理或化學(xué)方法殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使其達(dá)到無害化。試驗菌殺滅率≥%以上，或?qū)ψ匀痪鷼缏省?0%以上可判為符合消毒使用要求。五、滅菌：使產(chǎn)品無任何類型存活微生物的過程。即用物理或化學(xué)方法殺滅傳播媒介上所有的微生物，使其達(dá)到無菌。在殺菌試驗中為便于給結(jié)果做出評價，除有特殊規(guī)定外，將試驗菌芽孢（菌量≥106cfu）滅菌指數(shù)達(dá)到106 ，也就是說，滅菌后1000000（一百萬件）滅菌物中，只允許有一件以下有活的微生物存在，或自然微生物全部殺滅者為滅菌合格≥% 。六、生物指示物對特定滅菌處理有確定的抗力，并裝在內(nèi)層包裝中可供使用的染菌載體。用于監(jiān)測消毒或滅菌效果。指示物包括指示卡、片、條、帶、器等各種形式的指示器件。對用于監(jiān)測環(huán)氧乙烷滅菌效果的菌片，試驗微生物的額定總數(shù)必須不小于1*106 cfu。環(huán)氧乙烷滅菌以枯草桿菌黑色變種芽孢（ATCC9372）為指示菌，滅活指數(shù)達(dá)到106。生物指示物分菌片式生物指示物和自含式生物指示物二種。自含式生物指示物是兼菌片與培養(yǎng)基為一體的生物指示物。生物指示物國家標(biāo)準(zhǔn)： 《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物指示物 第2部分：環(huán)氧乙烷滅菌用生物指示物》生物指示物的性能會受到使用前的貯存環(huán)境、使用方法或暴露于滅菌工藝所用技術(shù)的影響，因此，應(yīng)遵守生產(chǎn)者的建議進(jìn)行貯存和使用，而且應(yīng)當(dāng)在暴露于滅菌工藝之后，盡快地把生物指示物轉(zhuǎn)至規(guī)定條件下復(fù)蘇。生物指示物超過了規(guī)定的有效期不得使用。進(jìn)行微生物性能鑒定時對生物指示物應(yīng)選用：有衛(wèi)生許可證與產(chǎn)品注冊證的產(chǎn)品；2；產(chǎn)品應(yīng)有合格證；應(yīng)使用同一生產(chǎn)廠家的同一批號產(chǎn)品，做滅菌驗證。，并符合標(biāo)準(zhǔn)要求。通過活菌計數(shù)，進(jìn)行該數(shù)目的追溯性測定。假若所獲得的數(shù)目是在生產(chǎn)者規(guī)定的額定總數(shù)50%和+300%范圍之內(nèi)，或處于生產(chǎn)者規(guī)定總數(shù)的最小值與最大值中間，應(yīng)判為合格。檢驗方法： 附錄A七、化學(xué)指示物暴露于滅菌工藝后，以顯示物質(zhì)發(fā)生物理和（或）化學(xué)變化來指示滅菌過程的化學(xué)制品。常通過顏色或形態(tài)改變來指示殺菌因子強度或消毒滅菌情況?；瘜W(xué)指示物包括指示卡、片、條、帶、器等各種形式的指示器件。用于指示環(huán)氧乙烷滅菌過程化學(xué)指示物，常用的有天津大學(xué)的圓形紙質(zhì)化學(xué)指示片和美國3M公司的“斑馬帶”。目前環(huán)氧乙烷化學(xué)指示物變色原理有三大類：酸堿法偶氮染料反應(yīng)法特效反應(yīng)法根據(jù)變色原理，化學(xué)指示物在使用前或滅菌后應(yīng)避免化學(xué)物接觸，使指示物變色或產(chǎn)生可逆反應(yīng)?；瘜W(xué)指示物國家標(biāo)準(zhǔn)： 《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 化學(xué)指示物 第1部分：通則》八、環(huán)氧乙烷環(huán)氧乙烷（Ethylene Oxide 簡稱EO）,又名氧化乙烯，分子式C2H4O,，EO的這種小分子、不穩(wěn)定三元環(huán)結(jié)構(gòu)，使它具有很強的化學(xué)活潑性和穿透性。在4℃,℃,因此EO在常溫常壓下是氣態(tài)，比空氣重，,揮發(fā)時具有芳香的醚味，可聞出的氣味閾值為500～700ppm。EO液體無色透明，可與任何比例的水混溶，也可溶于常用的有機溶劑或油脂。環(huán)氧乙烷的蒸氣壓較大，因此對滅菌物品的穿透力很強，可以穿透微孔而達(dá)到物品的深部，正是由于EO的這種深穿透性，使其具有很好的滅菌能力，在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛采用先包裝后滅菌的方法。環(huán)氧乙烷易燃易爆，當(dāng)它在空氣中含量為3%～80%時，就形成爆炸性混合氣體，遇明火時發(fā)生燃燒或爆炸，并釋放大量熱能，因此使用環(huán)氧乙烷滅菌時應(yīng)特別注意這種潛在的危險性，采取相應(yīng)的安全措施。環(huán)氧乙烷化學(xué)性質(zhì)活潑，與催化劑接觸可引起聚合反應(yīng)，這種聚合反應(yīng)隨溫度、壓力和水量增加而加快。該反應(yīng)若發(fā)生在鋼瓶內(nèi)，可使環(huán)氧乙烷顏色加深，產(chǎn)生黃色粘稠狀物，堵塞管道，影響滅菌效果。故環(huán)氧乙烷鋼瓶應(yīng)陰涼保存并規(guī)定其有效期。環(huán)氧乙烷還可與惰性氣體（如：二氧化碳CO2，氮氣N2）相混合成混合氣體，常用的比例環(huán)氧乙烷占10%、20%、30% ?；旌蠚怏w安全性好，滅菌時穿透性更好，有益于滅菌效果。應(yīng)當(dāng)指出，由于種種原因，當(dāng)前我國還有相當(dāng)多的一次性使用無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，出廠前滅菌還采用純環(huán)氧乙烷，隨著產(chǎn)品包裝質(zhì)量提高、技術(shù)進(jìn)步，隨著混合氣體供應(yīng)商產(chǎn)量增大，成本降低，供應(yīng)網(wǎng)點增加，工業(yè)滅菌中使用安全、有效的混合氣體來代替純環(huán)氧乙烷必將是發(fā)展趨勢。環(huán)氧乙烷對人的毒害作用主要表現(xiàn)在直接接觸和吸入。吸入環(huán)氧乙烷氣體能刺激呼吸道，量多時可發(fā)生急性中毒；環(huán)氧乙烷氣體或液體對皮膚也有毒害作用，若不慎將環(huán)氧乙烷濺到皮膚上或眼內(nèi)，應(yīng)立即用水沖洗。一次性無菌醫(yī)療器械滅菌用環(huán)氧乙烷應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB1309891《工業(yè)環(huán)氧乙烷》。九、環(huán)氧乙烷滅菌機理環(huán)氧乙烷可有效殺滅各種微生物，包括細(xì)菌繁殖體、芽孢、病毒和真菌孢子，是一種廣譜高效滅菌劑。其殺菌機理主要是由于EO能與細(xì)菌蛋白質(zhì)上的羧基(COOH)、氨基(NH2 )、巰基(SH)和羥基(OH)發(fā)生烷基化反應(yīng)使蛋白質(zhì)失去在基本代謝中需要的反應(yīng)基，阻礙了細(xì)菌蛋白質(zhì)正常的化學(xué)反應(yīng)和新陳代謝而導(dǎo)致微生物死亡。其反應(yīng)如下： COOH COOC2H4OH蛋白質(zhì) NH2 + CH2 CH2 O 蛋白質(zhì) NHC2H4OH SH S C2H4OH OH O C2H4OH注：環(huán)氧乙烷氣體滅菌時對濕度有要求。當(dāng)相對濕度低于25%以下時，不可能達(dá)到滅菌，即使延長滅菌時間也無效。十、 乙烷殘留量經(jīng)環(huán)氧乙烷處理后，殘留、吸附在物品中環(huán)氧乙烷的量。不同的物品環(huán)氧乙烷殘留量要求不同，目前對一次性醫(yī)療用品出廠時環(huán)氧乙烷殘留量的要求為不大于10μg/g（GB159801995 《一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》）；滅菌環(huán)境中環(huán)氧乙烷的濃度應(yīng)低于2mg/m3（GB1172189 《車間空氣中環(huán)氧乙烷衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》）。影響環(huán)氧乙烷殘留量的因素很多，主要與材料的組成、包裝、滅菌時環(huán)氧乙烷濃度、作用時間及解析方法、季節(jié)等因素有關(guān)，建議有條件的廠家采用混合氣滅菌及紙塑包裝來降低環(huán)氧乙烷殘留量。十一、滅菌周期實施環(huán)氧乙烷滅菌的全過程。在一密閉的柜室內(nèi)，包括進(jìn)行去除空氣、處理（若采用）、加入滅菌劑、EO作用、去除EO和換氣（若采用）的一系列處理步驟。十二、環(huán)氧乙烷驗證按照規(guī)定的程序，評價滅菌周期所采用的工藝技術(shù)參數(shù)是否達(dá)到滅菌要求的方法。十三、D值殺滅90%微生物個體所需的時間（min）。十四、參數(shù)放行根據(jù)物理和（或）化學(xué)處理的數(shù)據(jù)，而不是根據(jù)樣品檢驗或生物指示物的反應(yīng)結(jié)果，決定產(chǎn)品無菌。目前我國一次性醫(yī)療用品行業(yè)一般不采用。十五、產(chǎn)品放行根據(jù)滅菌過程物理參數(shù)和生物指示物培養(yǎng)結(jié)果來評價滅菌過程，決定產(chǎn)品的放行。生物指示物總是應(yīng)當(dāng)與物理的和（或）化學(xué)的監(jiān)測配合在一起使用，以證明滅菌工藝的功效。不管生物指示物獲得的結(jié)果如何，若滅菌工藝的某物理/化學(xué)變量超了規(guī)定范圍，滅菌周期均應(yīng)視作未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。產(chǎn)品放行中常用的生物學(xué)性能鑒定方法之一為半周期法。十六、半周期法除時間外所有其他過程參數(shù)不變情況下，確定無存活菌的EO最短作用時間。應(yīng)再重復(fù)兩次實驗來證實該最短滅菌時間，兩次重復(fù)試驗均應(yīng)無菌生長。規(guī)定的作用時間應(yīng)至少為最短滅菌時間的2倍。半周期法的實際應(yīng)用方法為：以初始滅菌工藝的滅菌時間為起點，以試驗生物指示物無菌為標(biāo)準(zhǔn)，在保證其他滅菌工藝參數(shù)不變的情況下，逐次將滅菌時間減半，直至找出試驗生物指示物無菌的EO最短作用時間（時間臨