【正文】 中能迅速與分子氧反應(yīng)生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。 3. 線(xiàn)粒體(mitochondria) 它是細(xì)胞中進(jìn)行呼吸作用的主要場(chǎng)所。據(jù)報(bào)道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗(yàn)中，對(duì)線(xiàn)粒體呼吸功能有明顯抑制作用。又據(jù)報(bào)道鎘對(duì)大鼠肝細(xì)胞線(xiàn)粒體Ca2+ATPase有抑制作用，且使線(xiàn)粒體膜脂流動(dòng)性下降。 (七) 酶 外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。 在體外毒理學(xué)中則主要是定量研究外源化學(xué)物對(duì)靶酶作用的特征、性質(zhì)和機(jī)理。此類(lèi)研究的基礎(chǔ)工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對(duì)純化酶作用的體征、性質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行研究，如細(xì)胞色素P450重組系統(tǒng)。由于酶的提純技術(shù)復(fù)雜，故而在一般毒理學(xué)研究中多用臟器勻漿和亞細(xì)胞組分作為酶源。雖然這些酶源標(biāo)本含有多酶成分，但是只要測(cè)定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結(jié)果。 有報(bào)道金屬離子Cd2+、Hg2+、Pb2+對(duì)一些鈣調(diào)素依賴(lài)酶就具有雙向效應(yīng)，即在低濃度時(shí)可以激活這些酶，而高濃度時(shí)又可抑制酶的活性。 文獻(xiàn)中早已證明有機(jī)磷化合物的主要靶酶是AChE。經(jīng)酶動(dòng)力學(xué)分析，有機(jī)磷化合物與AChE底物ACh呈競(jìng)爭(zhēng)性；即有機(jī)磷化合物對(duì)AChE為競(jìng)爭(zhēng)性的不可逆性抑制物。但是不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷化合物對(duì)AChE的親合力可有很大差別。 第二節(jié) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備和培養(yǎng) 一、概述 到目前為止，分離的細(xì)胞是毒理學(xué)中使用最廣泛和最深入的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。體外系統(tǒng)分離的細(xì)胞包括懸浮液中的新鮮游離細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株、細(xì)胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞。在毒理學(xué)中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢(shì)的原因有三：一是來(lái)自公眾要求減少實(shí)驗(yàn)中使用動(dòng)物數(shù)量的壓力；二是非整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可顯著地減少常規(guī)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的高額費(fèi)用；三是人們?cè)絹?lái)越不滿(mǎn)意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。利用細(xì)胞，可更嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，有效地研究毒性作用的生化機(jī)理。表122詳細(xì)列出細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)。 表122 體外系統(tǒng)——細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 改善效率，減少費(fèi)用 使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細(xì)胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時(shí)間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)取樣 缺點(diǎn) 缺少整個(gè)器官的形態(tài)學(xué)觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 多為短期試驗(yàn)，對(duì)亞慢性或慢性毒性的評(píng)估價(jià)值不大表123 毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞各種物種的成纖維細(xì)胞淋巴母細(xì)胞腹水瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞肝 細(xì) 胞肝癌細(xì)胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞肺的各種類(lèi)型細(xì)胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞膀胱細(xì)胞心臟細(xì)胞脊髓微血管細(xì)胞脂肪細(xì)胞 由于哺乳細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學(xué)中，已有許多不同類(lèi)型細(xì)胞應(yīng)用于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。表123為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞類(lèi)型，其中有些細(xì)胞可來(lái)源于人體組織。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行毒理學(xué)體外實(shí)驗(yàn)有兩種方法：一是建立正在迅速生長(zhǎng)的細(xì)胞株，用以觀察受試物對(duì)整體細(xì)胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是利用已高度分化的細(xì)胞，無(wú)論是原代培養(yǎng)或是特定的細(xì)胞株，研究受試物對(duì)已分化成熟的細(xì)胞或其功能的特殊毒作用； 二、基本技術(shù)（一） 儀器與設(shè)備 1. 培養(yǎng)箱 一般來(lái)說(shuō)，在5％CO2，95％空氣和99％的相對(duì)濕度的條件下，許多細(xì)胞可存活。故細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是CO2培養(yǎng)箱。其基本要求：①精確地溫度控制調(diào)節(jié)，℃，箱內(nèi)溫度的均衡可依賴(lài)風(fēng)扇；②CO2濃度調(diào)節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測(cè)箱內(nèi)CO2濃度；使箱內(nèi)大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內(nèi)濕度，可用水盤(pán)來(lái)維持。有的細(xì)胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。例如，原代肝細(xì)胞培養(yǎng)，可用LeibovitzL5介質(zhì)，不需CO2，而要求敞開(kāi)培養(yǎng)瓶，以供給較高的O2分壓。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—20℃)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺(tái)簡(jiǎn)單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細(xì)胞，以便依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，進(jìn)行調(diào)整或?qū)ξ廴具M(jìn)行補(bǔ)救或處理。進(jìn)行進(jìn)一步的研究，則需要更高級(jí)的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺(tái) 在沒(méi)有無(wú)菌操作室的條件下；可用超凈工作臺(tái)。它是一無(wú)菌操作裝置，主要是利用鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾膜凈化后，緩緩?fù)ㄟ^(guò)工作臺(tái)面，使工作部位構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但它尚難絕對(duì)除去病毒類(lèi)微生物，而且灰塵過(guò)多對(duì)凈化作用不利，故超凈工作臺(tái)最好安置在清潔無(wú)塵的房間。 5. 清洗和消毒設(shè)置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650500500mm。 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無(wú)毒性、有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。主要的塑料瓶皿有；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)；②培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)；③培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；④其它：凍存細(xì)胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有200~1000μ1和1μl~100μl二種。 玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲(chǔ)貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml； ③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細(xì)胞洗滌。 7. 液氮貯存器 貯存細(xì)胞多用液氮，液氮溫度在196℃，具有經(jīng)濟(jì)、省力和能較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)。液氮貯存器有25L和50L兩種規(guī)格，它與液氮運(yùn)輸瓶，或稱(chēng)杜瓦瓶不同，因液氮貯存器一般每?jī)芍苄柩a(bǔ)充一次液氮。如有需要可配置貯存器和運(yùn)輸瓶。 8. 水純化裝置 細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。對(duì)玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。但是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機(jī)物。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備自動(dòng)加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點(diǎn)。外購(gòu)蒸餾水或去離子，應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室重蒸后使用。對(duì)水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)常檢測(cè)，如pH和電導(dǎo)系數(shù)。同一實(shí)驗(yàn)盡量使用同一水源，避免水質(zhì)量造成結(jié)果的差異。 9. 濾過(guò)消毒裝置 培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒。濾過(guò)消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。10. 一般設(shè)備 離心機(jī)，用于對(duì)細(xì)胞懸液離心處理，以達(dá)到細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度等。 天平，包括普通臺(tái)秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養(yǎng)液、酶消化液及生理鹽水等。 酸度計(jì)，用于準(zhǔn)確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。 電磁攪拌器，微量加樣器等。 (二) 培養(yǎng)用液 指細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細(xì)胞洗滌液等。培養(yǎng)液的選擇取決于細(xì)胞生長(zhǎng)的要求，故它是維持細(xì)胞生存和生長(zhǎng)所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應(yīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的各種溶液。 培養(yǎng)液在制備過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格操作，避免混入雜質(zhì)。應(yīng)特別注意下列問(wèn)題：①容器，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真清洗，必要時(shí)須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴(yán)格選擇品質(zhì)優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質(zhì)要標(biāo)明名稱(chēng)、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細(xì)胞生存所需的能量和無(wú)機(jī)鹽的成分。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎(chǔ)溶液，也是洗滌細(xì)胞的溶液。 2. 小牛血清 是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞附著和保護(hù)也有明顯的作用。但它有成分較為復(fù)雜、個(gè)體差異較大、來(lái)源也有一定的限制等不足。彌補(bǔ)個(gè)體差異的辦法是對(duì)血清進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)和支持生長(zhǎng)能力測(cè)定后，混合使用。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。 3. 合成培養(yǎng)基 系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的。如最簡(jiǎn)單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。根據(jù)需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類(lèi)化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。 如進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)，除上述營(yíng)養(yǎng)成分外，還應(yīng)加入纖維連結(jié)素、多聚賴(lài)氨酸和膠原等成分以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。有時(shí)，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。 4. 消化液 進(jìn)行傳代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為了使細(xì)胞脫離生長(zhǎng)表面和細(xì)胞離散成單個(gè)細(xì)胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(％％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液(％)。 5. 其它 pH調(diào)整液，為了營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長(zhǎng)貯存時(shí)間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時(shí)，均在臨用前加入NaHCO3溶液。％、％%。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間保持恒定的pH值范圍。使用終濃度為10～15mmol／L。 染色液：常用的有①；②Giemsa染色液。 固定液：常用的有①中性緩沖福爾馬林，相當(dāng)于10％的福爾馬林；②Bouin氏固定液；③醋酸甲醇，臨用前配制，結(jié)合Giemsa染色效果較好；④FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80％酒精組成，用于蓋片單層培養(yǎng)的固定。 (三) 消毒技術(shù) 在細(xì)胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項(xiàng)工作，它直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。消毒措施應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格執(zhí)行。細(xì)胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細(xì)菌、真菌及病毒，它們主要來(lái)源于：操作者的粗心；操作表面或周?chē)沫h(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時(shí)間過(guò)久等。 對(duì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。一般有兩類(lèi)：一是物理滅菌法，即利用紫外線(xiàn)、干熱及微孔過(guò)濾等；二是化學(xué)滅菌法，即利用化學(xué)消毒劑。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線(xiàn) 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。應(yīng)注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。 2. 高壓蒸氣消毒 它適于金屬器械、膠塞、布類(lèi)及某些培養(yǎng)液。一般要求15磅壓力下20min?；蛘吒?jiǎn)單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。加溫應(yīng)到160℃，保持90120min。 4. 濾過(guò)消毒 適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。，過(guò)濾除菌效果較佳。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺(tái)面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來(lái)蘇兒、新潔爾滅、過(guò)氧乙酸及70％酒精。 三、培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定有兩個(gè)目的：一是觀察培養(yǎng)有無(wú)變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細(xì)胞；二是培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的一致性，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性有極為重要的影響。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標(biāo)及細(xì)胞性質(zhì)(如細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。 (一) 污染鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。受到污染的細(xì)胞培養(yǎng)可明顯地改變生長(zhǎng)特性，引起pH變化和生長(zhǎng)遲緩。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細(xì)胞生長(zhǎng)表面的斑點(diǎn)，搖動(dòng)培養(yǎng)器皿可消失。肉眼見(jiàn)不到的污染可影響細(xì)胞的代謝。 1. 鑒定方法 真菌或細(xì)菌的污染可用肉眼或低倍光學(xué)顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學(xué)顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。由于用肉眼無(wú)法發(fā)現(xiàn)支原體的污染，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)經(jīng)常定期檢查，例如每三個(gè)月。最簡(jiǎn)便和最可靠的檢測(cè)支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。 2. 處理 基本的良好消毒技術(shù)并不一定能防止污染，還應(yīng)注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護(hù)罩的消毒效果；經(jīng)常檢查培養(yǎng)器皿；每個(gè)工作者有自己配制的培養(yǎng)用液，處理受污染的培養(yǎng)用具和環(huán)境。％高氯酸處理。用抗生素對(duì)預(yù)防或去除細(xì)菌污染較為有效。對(duì)支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動(dòng)物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿(mǎn)意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。 (二) 生存指標(biāo) 1. 臺(tái)