【正文】 中能迅速與分子氧反應生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。 3. 線粒體(mitochondria) 它是細胞中進行呼吸作用的主要場所。據(jù)報道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗中，對線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。又據(jù)報道鎘對大鼠肝細胞線粒體Ca2+ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動性下降。 (七) 酶 外源化學物對機體的毒性效應，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標志酶活性的變化反映化學物所損傷的靶器官。 在體外毒理學中則主要是定量研究外源化學物對靶酶作用的特征、性質(zhì)和機理。此類研究的基礎工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對純化酶作用的體征、性質(zhì)和機理進行研究，如細胞色素P450重組系統(tǒng)。由于酶的提純技術復雜，故而在一般毒理學研究中多用臟器勻漿和亞細胞組分作為酶源。雖然這些酶源標本含有多酶成分，但是只要測定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結果。 有報道金屬離子Cd2+、Hg2+、Pb2+對一些鈣調(diào)素依賴酶就具有雙向效應，即在低濃度時可以激活這些酶，而高濃度時又可抑制酶的活性。 文獻中早已證明有機磷化合物的主要靶酶是AChE。經(jīng)酶動力學分析，有機磷化合物與AChE底物ACh呈競爭性；即有機磷化合物對AChE為競爭性的不可逆性抑制物。但是不同結構的有機磷化合物對AChE的親合力可有很大差別。 第二節(jié) 哺乳動物細胞制備和培養(yǎng) 一、概述 到目前為止，分離的細胞是毒理學中使用最廣泛和最深入的體外實驗系統(tǒng)。體外系統(tǒng)分離的細胞包括懸浮液中的新鮮游離細胞、原代培養(yǎng)細胞、細胞株、細胞系及復合培養(yǎng)的細胞。在毒理學中以哺乳動物細胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢的原因有三：一是來自公眾要求減少實驗中使用動物數(shù)量的壓力；二是非整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗所需的高額費用；三是人們越來越不滿意實驗動物與人體結果之間相關性的缺乏。利用細胞，可更嚴格控制實驗條件，有效地研究毒性作用的生化機理。表122詳細列出細胞在毒理學中應用的優(yōu)缺點。 表122 體外系統(tǒng)——細胞在毒理學中應用的優(yōu)、缺點 優(yōu)點 改善效率，減少費用 使用實驗動物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學物濃度及接觸時間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實驗體系重復取樣 缺點 缺少整個器官的形態(tài)學觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大表123 毒理學研究中常用細胞各種物種的成纖維細胞淋巴母細胞腹水瘤細胞淋巴細胞角質(zhì)細胞肝 細 胞肝癌細胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細胞肺的各種類型細胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細胞培養(yǎng)的睪丸細胞膀胱細胞心臟細胞脊髓微血管細胞脂肪細胞 由于哺乳細胞作為體外實驗系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學中，已有許多不同類型細胞應用于毒理學實驗。表123為毒理學實驗中常用的細胞類型，其中有些細胞可來源于人體組織。利用哺乳動物細胞進行毒理學體外實驗有兩種方法：一是建立正在迅速生長的細胞株，用以觀察受試物對整體細胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是利用已高度分化的細胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細胞株，研究受試物對已分化成熟的細胞或其功能的特殊毒作用； 二、基本技術（一） 儀器與設備 1. 培養(yǎng)箱 一般來說，在5％CO2，95％空氣和99％的相對濕度的條件下，許多細胞可存活。故細胞培養(yǎng)的關鍵設備是CO2培養(yǎng)箱。其基本要求：①精確地溫度控制調(diào)節(jié)，℃，箱內(nèi)溫度的均衡可依賴風扇；②CO2濃度調(diào)節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測箱內(nèi)CO2濃度；使箱內(nèi)大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內(nèi)濕度，可用水盤來維持。有的細胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。例如，原代肝細胞培養(yǎng)，可用LeibovitzL5介質(zhì)，不需CO2，而要求敞開培養(yǎng)瓶，以供給較高的O2分壓。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—20℃)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細胞，以便依據(jù)細胞生長狀況，進行調(diào)整或?qū)ξ廴具M行補救或處理。進行進一步的研究，則需要更高級的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺 在沒有無菌操作室的條件下；可用超凈工作臺。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風機，驅(qū)動空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩通過工作臺面，使工作部位構成無菌環(huán)境。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點，但它尚難絕對除去病毒類微生物，而且灰塵過多對凈化作用不利，故超凈工作臺最好安置在清潔無塵的房間。 5. 清洗和消毒設置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650500500mm。 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無毒性、有利于細胞生長的優(yōu)點。主要的塑料瓶皿有；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細胞轉(zhuǎn)化等試驗；③培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；④其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有200~1000μ1和1μl~100μl二種。 玻璃器皿在實驗室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml； ③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細胞洗滌。 7. 液氮貯存器 貯存細胞多用液氮，液氮溫度在196℃，具有經(jīng)濟、省力和能較好保持細胞生物學特性的優(yōu)點。液氮貯存器有25L和50L兩種規(guī)格，它與液氮運輸瓶，或稱杜瓦瓶不同，因液氮貯存器一般每兩周需補充一次液氮。如有需要可配置貯存器和運輸瓶。 8. 水純化裝置 細胞培養(yǎng)對水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。對玻璃器皿也應用純水清洗。但是，在細胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。 實驗室應配備自動加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點。外購蒸餾水或去離子，應在本實驗室重蒸后使用。對水質(zhì)量應經(jīng)常檢測，如pH和電導系數(shù)。同一實驗盡量使用同一水源，避免水質(zhì)量造成結果的差異。 9. 濾過消毒裝置 培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。10. 一般設備 離心機，用于對細胞懸液離心處理，以達到細胞洗滌、調(diào)節(jié)細胞濃度等。 天平，包括普通臺秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養(yǎng)液、酶消化液及生理鹽水等。 酸度計，用于準確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。 電磁攪拌器，微量加樣器等。 (二) 培養(yǎng)用液 指細胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細胞洗滌液等。培養(yǎng)液的選擇取決于細胞生長的要求，故它是維持細胞生存和生長所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應細胞體外培養(yǎng)的各種溶液。 培養(yǎng)液在制備過程中應嚴格操作，避免混入雜質(zhì)。應特別注意下列問題：①容器，應仔細認真清洗，必要時須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴格選擇品質(zhì)優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質(zhì)要標明名稱、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細胞生存所需的能量和無機鹽的成分。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎溶液，也是洗滌細胞的溶液。 2. 小牛血清 是細胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對細胞附著和保護也有明顯的作用。但它有成分較為復雜、個體差異較大、來源也有一定的限制等不足。彌補個體差異的辦法是對血清進行無菌檢測和支持生長能力測定后，混合使用。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。 3. 合成培養(yǎng)基 系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質(zhì)模擬合成的。如最簡單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。根據(jù)需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。 如進行無血清培養(yǎng)，除上述營養(yǎng)成分外，還應加入纖維連結素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進細胞貼壁。有時，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。 4. 消化液 進行傳代細胞培養(yǎng)時，為了使細胞脫離生長表面和細胞離散成單個細胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(％％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液(％)。 5. 其它 pH調(diào)整液，為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時，均在臨用前加入NaHCO3溶液。％、％%。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間保持恒定的pH值范圍。使用終濃度為10～15mmol／L。 染色液：常用的有①；②Giemsa染色液。 固定液：常用的有①中性緩沖福爾馬林，相當于10％的福爾馬林；②Bouin氏固定液；③醋酸甲醇，臨用前配制，結合Giemsa染色效果較好；④FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80％酒精組成，用于蓋片單層培養(yǎng)的固定。 (三) 消毒技術 在細胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項工作，它直接影響實驗的結果。消毒措施應在細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)嚴格執(zhí)行。細胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時間過久等。 對不同的細胞培養(yǎng)所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學滅菌法，即利用化學消毒劑。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。應注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。 2. 高壓蒸氣消毒 它適于金屬器械、膠塞、布類及某些培養(yǎng)液。一般要求15磅壓力下20min。或者更簡單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。加溫應到160℃，保持90120min。 4. 濾過消毒 適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。，過濾除菌效果較佳。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70％酒精。 三、培養(yǎng)細胞的鑒定 對培養(yǎng)細胞的鑒定有兩個目的：一是觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細胞；二是培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對培養(yǎng)細胞的影響。因為培養(yǎng)條件的一致性，對于實驗結果的可信性有極為重要的影響。對于培養(yǎng)細胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標及細胞性質(zhì)(如細胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結構等)。 (一) 污染鑒定 細胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學物和非同一種細胞的污染。受到污染的細胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。肉眼見不到的污染可影響細胞的代謝。 1. 鑒定方法 真菌或細菌的污染可用肉眼或低倍光學顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。由于用肉眼無法發(fā)現(xiàn)支原體的污染，在細胞培養(yǎng)過程中應經(jīng)常定期檢查，例如每三個月。最簡便和最可靠的檢測支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。 2. 處理 基本的良好消毒技術并不一定能防止污染，還應注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護罩的消毒效果；經(jīng)常檢查培養(yǎng)器皿；每個工作者有自己配制的培養(yǎng)用液，處理受污染的培養(yǎng)用具和環(huán)境。％高氯酸處理。用抗生素對預防或去除細菌污染較為有效。對支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。 (二) 生存指標 1. 臺