【正文】 以下重點(diǎn)討論毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題。此項(xiàng)指標(biāo)可用于正常細(xì)胞生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)，貯存細(xì)胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。在實(shí)際工作中，是測(cè)定克隆效率或者接種效率。雖然不同的細(xì)胞其傳代時(shí)間和更換培養(yǎng)液的時(shí)間不同，但對(duì)于每一細(xì)胞系應(yīng)該較為固定，因?yàn)橹饕Q于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。要詳細(xì)地描述每一細(xì)胞系的形態(tài)。 (三) 細(xì)胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細(xì)胞可能發(fā)生某些變化，如細(xì)胞與原始細(xì)胞的差異逐漸加大。計(jì)算上清或沉淀(即溶液中細(xì)胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養(yǎng)液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細(xì)胞沉淀，用漩渦混合器混合。配好后，可貯存于20℃的冰箱內(nèi)。 2. 酶漏出的檢測(cè) 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測(cè)也與染料排斥試驗(yàn)有同樣的靈敏度，同時(shí)，可更精確地進(jìn)行定量，但操作時(shí)間較長(zhǎng)。具體方法如下： ①取少量細(xì)胞混懸液，％臺(tái)盼藍(lán)溶液。％高氯酸處理。 1. 鑒定方法 真菌或細(xì)菌的污染可用肉眼或低倍光學(xué)顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學(xué)顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。 (一) 污染鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺(tái)面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來(lái)蘇兒、新潔爾滅、過(guò)氧乙酸及70％酒精。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。應(yīng)注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。細(xì)胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細(xì)菌、真菌及病毒，它們主要來(lái)源于：操作者的粗心；操作表面或周?chē)沫h(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時(shí)間過(guò)久等。 染色液：常用的有①；②Giemsa染色液。 5. 其它 pH調(diào)整液，為了營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長(zhǎng)貯存時(shí)間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時(shí)，均在臨用前加入NaHCO3溶液。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。如最簡(jiǎn)單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。但它有成分較為復(fù)雜、個(gè)體差異較大、來(lái)源也有一定的限制等不足。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。 (二) 培養(yǎng)用液 指細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細(xì)胞洗滌液等。10. 一般設(shè)備 離心機(jī)，用于對(duì)細(xì)胞懸液離心處理，以達(dá)到細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度等。對(duì)水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)常檢測(cè)，如pH和電導(dǎo)系數(shù)。對(duì)玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。 7. 液氮貯存器 貯存細(xì)胞多用液氮，液氮溫度在196℃，具有經(jīng)濟(jì)、省力和能較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。 5. 清洗和消毒設(shè)置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650500500mm。進(jìn)行進(jìn)一步的研究，則需要更高級(jí)的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。有的細(xì)胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。表123為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞類(lèi)型，其中有些細(xì)胞可來(lái)源于人體組織。利用細(xì)胞，可更嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，有效地研究毒性作用的生化機(jī)理。但是不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷化合物對(duì)AChE的親合力可有很大差別。雖然這些酶源標(biāo)本含有多酶成分，但是只要測(cè)定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結(jié)果。 (七) 酶 外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。 有報(bào)道TNT在無(wú)氧而加人NADPH環(huán)境下與微粒體溫育，用ESR波譜儀檢測(cè)出硝基陰離子自由基(ArNO2￣)；而在有氧環(huán)境中能迅速與分子氧反應(yīng)生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。實(shí)驗(yàn)表明對(duì)硫磷在5109mol／L水平即可抑制突觸體的攝鈣功能，并引起突觸體膜脂流動(dòng)性下降。此外肺巨噬細(xì)胞、肺細(xì)胞、突觸小體等均可制備膜標(biāo)本(先將細(xì)胞勻漿破膜，低溫差速離心、梯度離心制備)。它較組織勻漿優(yōu)越，排除了勻漿中其它因素的影響。 文獻(xiàn)中有機(jī)磷化合物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)Ache抑制的強(qiáng)度及特征，大量工作是通過(guò)以腦勻漿為標(biāo)本，主要是以哺乳動(dòng)物、嚙齒類(lèi)和昆蟲(chóng)的腦完成的。 近十年來(lái)，毒理學(xué)相繼引入嚙齒類(lèi)動(dòng)物的著床前全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(preimplantatation whole embryo culture)、著床后全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(postimplantation whole embryo culture)，以及器官培養(yǎng)如腭板培養(yǎng)、胚胎枝芽體外培養(yǎng)等篩檢致畸化學(xué)物均取得一些成果。例如我國(guó)用人胚肺纖維母細(xì)胞傳代培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞，已建立了以2BS為代表的株系。據(jù)報(bào)道此株系細(xì)胞的各種生物學(xué)特征已進(jìn)行了相當(dāng)深入的研究(包括激素應(yīng)答反應(yīng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特征、細(xì)胞的代謝功能和標(biāo)志等)。 (四) 細(xì)胞培養(yǎng) 有些臟器細(xì)胞建立了傳代培養(yǎng)技術(shù)，建成有穩(wěn)定遺傳特征的細(xì)胞株系。經(jīng)記錄、分析各心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)，結(jié)果鎘在5～20μmol／L濃度下，可使心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及最大除極速率顯著降低，表明鎘對(duì)心肌有直接的毒性效應(yīng)。 4. 腦細(xì)胞 分離的新鮮腦細(xì)胞有助于研究外源化學(xué)物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的評(píng)價(jià)與探討其機(jī)理如用小鼠大腦皮質(zhì)分離、溫育后，研究二價(jià)陽(yáng)離子鈣、鎂、鋅、鎘等對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)現(xiàn)這些離子隨著濃度的增加，腦神經(jīng)細(xì)胞的電泳遷移率逐漸減慢。巨噬細(xì)胞可以用于多種體外試驗(yàn)，例如利用巨噬細(xì)胞的免疫功能檢測(cè)外源化學(xué)物的免疫毒性，又如利用巨噬細(xì)胞檢測(cè)以肺臟為毒理學(xué)終點(diǎn)的外源化學(xué)物的中毒毒性和機(jī)理。如研究化學(xué)物的肝臟毒性，一般認(rèn)為，用原代肝細(xì)胞培養(yǎng)篩檢與鑒定是否化學(xué)物具有肝臟毒性較為可靠，與體內(nèi)試驗(yàn)相符合。肝細(xì)胞原代培養(yǎng)期間細(xì)胞不分裂、不增殖，但發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄是存在的(培養(yǎng)初期24h在1％或以上)。不同研究期間有別，如肝切片研究CytP450不應(yīng)超過(guò)8h，腦切片一般在6h左右。這種標(biāo)本可用在研究神經(jīng)毒物對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)功能的損傷及強(qiáng)度。 2. 腸灌流 利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在灌流液中加入外源化學(xué)物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。但現(xiàn)階段毒理學(xué)作為一個(gè)學(xué)科的發(fā)展尚缺少許多重要的資料。體外試驗(yàn)是依據(jù)毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生的分子與細(xì)胞反應(yīng)，其與整體系統(tǒng)有差異，如何將產(chǎn)生體外毒性的體外濃度與相應(yīng)體內(nèi)劑量聯(lián)系的問(wèn)題是最終未解決的難題。在毒理學(xué)整體試驗(yàn)中禁止直接進(jìn)行人體試驗(yàn)。 (三) 體外試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn) 體外毒性試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)可歸納在表12—1。它是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗(yàn)?zāi)芴娲w動(dòng)物試驗(yàn)，以提供更多的信息。它僅提供決策過(guò)程的最初的資料，還需要進(jìn)行更權(quán)威的試驗(yàn)，無(wú)論是整體還是體外試驗(yàn)。在有些情況下，是要決定一種化學(xué)物在所預(yù)期的條件下使用是否安全，如新藥物開(kāi)發(fā)即需要這一評(píng)價(jià)。④更重要的是由于生物技術(shù)的巨大進(jìn)步，不僅表現(xiàn)在細(xì)胞組織及器官培養(yǎng)領(lǐng)域，而且在生物分子技術(shù)方面，也為毒性試驗(yàn)和研究提供了新的方法和工具。在此種情況下，利用經(jīng)典的整體動(dòng)物試驗(yàn)取得完整的毒理學(xué)資料極為困難。體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?in vitro test)在上述過(guò)程中也起著重要的作用，尤其是機(jī)理研究方面。過(guò)去利用整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或稱體內(nèi)試驗(yàn)(in vivo test)模型所提供的資料，判斷外源化學(xué)物及其制品和混合物等對(duì)人類(lèi)健康是否具有損害作用。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒(méi)有進(jìn)行必要的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。③動(dòng)物保護(hù)主義運(yùn)動(dòng)的興起，要求盡量減少動(dòng)物的使用，而且應(yīng)當(dāng)盡量減少痛苦地處理動(dòng)物。 一、概述 (一) 分類(lèi) 毒性試驗(yàn)的目的是提供一些適當(dāng)?shù)馁Y料，以便確定有關(guān)化學(xué)物的毒理學(xué)性質(zhì)?？梢罁?jù)體外試驗(yàn)在決策過(guò)程中所起的作用將其分為3類(lèi)：①篩選試驗(yàn)。③替代試驗(yàn)?；谏鲜鲈?，體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐?，可取哺乳?dòng)物的離體臟器灌流、臟器切片溫育、細(xì)胞培養(yǎng)、亞細(xì)胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。此外，對(duì)鑒定毒理學(xué)資料有問(wèn)題的新化學(xué)物，可及時(shí)終止開(kāi)發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。 體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)的利用在目前尚有不足之處：①體外到體內(nèi)外推的問(wèn)題。假如有了更全面的毒理學(xué)過(guò)程的基礎(chǔ)知識(shí)，可設(shè)計(jì)更符合整體動(dòng)物模型的體外系統(tǒng)。 二、體外試驗(yàn)系統(tǒng) (一) 臟器灌流 1. 肝臟灌流 是毒理學(xué)中研究外源化合物對(duì)肝臟損傷及代謝的常見(jiàn)方法。需指出肝灌流時(shí)間不能過(guò)久，以4h之內(nèi)為宜，否則肝細(xì)胞的功能與生存不能維持。 3. 膈肌膈神經(jīng)標(biāo)本 取完整的大鼠膈肌膈神經(jīng)置于恒溫灌流液中，在幾小時(shí)之內(nèi)可維持基本正常的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。切片厚度一般在250μm。 (三) 原代細(xì)胞培養(yǎng) 1. 肝細(xì)胞原代培養(yǎng) 肝細(xì)胞尚未建成傳代的細(xì)胞株系，多用原代培養(yǎng)。 利用原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞可以進(jìn)行多種毒理學(xué)研究。 2. 巨噬細(xì)胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法獲取肺巨噬細(xì)胞，小鼠可用腹腔灌洗獲得腹腔巨噬細(xì)胞，甚至人也可通過(guò)肺灌洗得到。例如研究鎘的免疫毒性，證明鎘可以抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抑制白細(xì)胞介素2的產(chǎn)生，且在一定條件下使淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加及鈣調(diào)素(CaM)活性降低，此為鎘的免疫毒性機(jī)理研究提供了線索。用新生1～2日齡大鼠心室肌分離心肌細(xì)胞，原代培養(yǎng)4天后，將微電極(直徑)插入細(xì)胞內(nèi)，研究鎘對(duì)心肌的影響。進(jìn)一步證實(shí)鎘對(duì)心肌有毒性效應(yīng)。例如1926年Hull等人選育傳代培養(yǎng)的LLCPK1細(xì)胞是來(lái)源于Hampshire豬。 2. 胚胎細(xì)胞 利用胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)，篩檢和研究外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)。 此外，人胚主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞也可作為標(biāo)本傳代培養(yǎng)研究金屬的毒理。最常使用的是腦勻漿、肝勻漿，雖然肺、腎、腸等臟器也可制備勻漿，但是因纖維結(jié)締組織或肌細(xì)胞不易破碎影響勻漿的質(zhì)量。 (六) 亞細(xì)胞組分 將細(xì)胞中各亞細(xì)胞組分分離和純化，對(duì)于深入研究外源化學(xué)物的靶位點(diǎn)、探討化學(xué)物毒性效應(yīng)的機(jī)理均十分重要。血影為常用的細(xì)胞膜標(biāo)本。 神經(jīng)末梢斷裂脫落的突觸體(synaptosome)具有類(lèi)似完整細(xì)胞的功能，除可利用突觸體作為標(biāo)本外，還可進(jìn)一步制備突觸體膜(synaptosome membrane)。 2. 微粒體(microsome) 尤其是肝細(xì)胞制備的微粒體常作為毒理學(xué)研究的標(biāo)本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，即肝細(xì)胞的亞細(xì)胞組分分離后的微粒體中。又據(jù)報(bào)道鎘對(duì)大鼠肝細(xì)胞線粒體Ca2+ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動(dòng)性下降。由于酶的提純技術(shù)復(fù)雜，故而在一般毒理學(xué)研究中多用臟器勻漿和亞細(xì)胞組分作為酶源。經(jīng)酶動(dòng)力學(xué)分析，有機(jī)磷化合物與AChE底物ACh呈競(jìng)爭(zhēng)性；即有機(jī)磷化合物對(duì)AChE為競(jìng)爭(zhēng)性的不可逆性抑制物。在毒理學(xué)中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢(shì)的原因有三：一是來(lái)自公眾要求減少實(shí)驗(yàn)中使用動(dòng)物數(shù)量的壓力；二是非整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可顯著地減少常規(guī)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的高額費(fèi)用；三是人們?cè)絹?lái)越不滿意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。 多為短期試驗(yàn)，對(duì)亞慢性或慢性毒性的評(píng)估價(jià)值不大表123 毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞各種物種的成纖維細(xì)胞淋巴母細(xì)胞腹水瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞肝 細(xì) 胞肝癌細(xì)胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞肺的各種類(lèi)型細(xì)胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞膀胱細(xì)胞心臟細(xì)胞脊髓微血管細(xì)胞脂肪細(xì)胞 由于哺乳細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學(xué)中，已有許多不同類(lèi)型細(xì)胞應(yīng)用于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。其基本要求：①精確地溫度控制調(diào)節(jié)，℃，箱內(nèi)溫度的均衡可依賴風(fēng)扇；②CO2濃度調(diào)節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測(cè)箱內(nèi)CO2濃度；使箱內(nèi)大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內(nèi)濕度，可用水盤(pán)來(lái)維持。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺(tái)簡(jiǎn)單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細(xì)胞，以便依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，進(jìn)行調(diào)整或?qū)ξ廴具M(jìn)行補(bǔ)救或處理。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但它尚難絕對(duì)除去病毒類(lèi)微生物，而且灰塵過(guò)多對(duì)凈化作用不利，故超凈工作臺(tái)最好安置在清潔無(wú)塵的房間。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。 玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲(chǔ)貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml； ③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細(xì)胞洗滌。 8. 水純化裝置 細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。外購(gòu)蒸餾水或去離子，應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室重蒸后使用。濾過(guò)消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。 電磁攪拌器，微量加樣器等。應(yīng)特別注意下列問(wèn)題：①容器，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真清洗，必要時(shí)須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴(yán)格選擇品質(zhì)優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質(zhì)要標(biāo)明名稱、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。 2. 小牛血清 是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞附著和保護(hù)也有明顯的作用。 3. 合成培養(yǎng)基 系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的。有時(shí)，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。常用的消化液有胰蛋白溶液(％％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液(％)。使用終濃度為10～15mmol／L。消毒措施應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格執(zhí)行。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好?；蛘吒?jiǎn)單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。過(guò)