【正文】 以下重點討論毒理學中應用細胞培養(yǎng)技術時應注意的幾個問題。此項指標可用于正常細胞生長的監(jiān)測，貯存細胞的復蘇及鑒定每一批血清等。在實際工作中，是測定克隆效率或者接種效率。雖然不同的細胞其傳代時間和更換培養(yǎng)液的時間不同，但對于每一細胞系應該較為固定，因為主要取決于細胞生長速率。要詳細地描述每一細胞系的形態(tài)。 (三) 細胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細胞可能發(fā)生某些變化，如細胞與原始細胞的差異逐漸加大。計算上清或沉淀(即溶液中細胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養(yǎng)液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細胞沉淀，用漩渦混合器混合。配好后，可貯存于20℃的冰箱內。 2. 酶漏出的檢測 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測也與染料排斥試驗有同樣的靈敏度，同時，可更精確地進行定量，但操作時間較長。具體方法如下： ①取少量細胞混懸液，％臺盼藍溶液。％高氯酸處理。 1. 鑒定方法 真菌或細菌的污染可用肉眼或低倍光學顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。 (一) 污染鑒定 細胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學物和非同一種細胞的污染。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70％酒精。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。應注意其可產生臭氧，影響健康。細胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時間過久等。 染色液：常用的有①；②Giemsa染色液。 5. 其它 pH調整液，為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時，均在臨用前加入NaHCO3溶液。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。如最簡單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。但它有成分較為復雜、個體差異較大、來源也有一定的限制等不足。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。 (二) 培養(yǎng)用液 指細胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調整液、染液及細胞洗滌液等。10. 一般設備 離心機，用于對細胞懸液離心處理，以達到細胞洗滌、調節(jié)細胞濃度等。對水質量應經常檢測，如pH和電導系數。對玻璃器皿也應用純水清洗。 7. 液氮貯存器 貯存細胞多用液氮，液氮溫度在196℃，具有經濟、省力和能較好保持細胞生物學特性的優(yōu)點。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。 5. 清洗和消毒設置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650500500mm。進行進一步的研究，則需要更高級的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。有的細胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。表123為毒理學實驗中常用的細胞類型，其中有些細胞可來源于人體組織。利用細胞，可更嚴格控制實驗條件，有效地研究毒性作用的生化機理。但是不同結構的有機磷化合物對AChE的親合力可有很大差別。雖然這些酶源標本含有多酶成分，但是只要測定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結果。 (七) 酶 外源化學物對機體的毒性效應，往往表現某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標志酶活性的變化反映化學物所損傷的靶器官。 有報道TNT在無氧而加人NADPH環(huán)境下與微粒體溫育，用ESR波譜儀檢測出硝基陰離子自由基(ArNO2￣)；而在有氧環(huán)境中能迅速與分子氧反應生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。實驗表明對硫磷在5109mol／L水平即可抑制突觸體的攝鈣功能，并引起突觸體膜脂流動性下降。此外肺巨噬細胞、肺細胞、突觸小體等均可制備膜標本(先將細胞勻漿破膜，低溫差速離心、梯度離心制備)。它較組織勻漿優(yōu)越，排除了勻漿中其它因素的影響。 文獻中有機磷化合物對神經系統(tǒng)Ache抑制的強度及特征，大量工作是通過以腦勻漿為標本，主要是以哺乳動物、嚙齒類和昆蟲的腦完成的。 近十年來，毒理學相繼引入嚙齒類動物的著床前全胚胎培養(yǎng)技術(preimplantatation whole embryo culture)、著床后全胚胎培養(yǎng)技術(postimplantation whole embryo culture)，以及器官培養(yǎng)如腭板培養(yǎng)、胚胎枝芽體外培養(yǎng)等篩檢致畸化學物均取得一些成果。例如我國用人胚肺纖維母細胞傳代培養(yǎng)人胚肺二倍體細胞，已建立了以2BS為代表的株系。據報道此株系細胞的各種生物學特征已進行了相當深入的研究(包括激素應答反應、物質轉運特征、細胞的代謝功能和標志等)。 (四) 細胞培養(yǎng) 有些臟器細胞建立了傳代培養(yǎng)技術，建成有穩(wěn)定遺傳特征的細胞株系。經記錄、分析各心肌細胞動作電位參數，結果鎘在5～20μmol／L濃度下，可使心肌細胞動作電位及最大除極速率顯著降低，表明鎘對心肌有直接的毒性效應。 4. 腦細胞 分離的新鮮腦細胞有助于研究外源化學物對神經系統(tǒng)損傷的評價與探討其機理如用小鼠大腦皮質分離、溫育后，研究二價陽離子鈣、鎂、鋅、鎘等對皮層神經細胞的損傷，發(fā)現這些離子隨著濃度的增加，腦神經細胞的電泳遷移率逐漸減慢。巨噬細胞可以用于多種體外試驗，例如利用巨噬細胞的免疫功能檢測外源化學物的免疫毒性，又如利用巨噬細胞檢測以肺臟為毒理學終點的外源化學物的中毒毒性和機理。如研究化學物的肝臟毒性，一般認為，用原代肝細胞培養(yǎng)篩檢與鑒定是否化學物具有肝臟毒性較為可靠，與體內試驗相符合。肝細胞原代培養(yǎng)期間細胞不分裂、不增殖，但發(fā)現基因轉錄是存在的(培養(yǎng)初期24h在1％或以上)。不同研究期間有別，如肝切片研究CytP450不應超過8h，腦切片一般在6h左右。這種標本可用在研究神經毒物對神經傳導功能的損傷及強度。 2. 腸灌流 利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動力學過程。在灌流液中加入外源化學物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。但現階段毒理學作為一個學科的發(fā)展尚缺少許多重要的資料。體外試驗是依據毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生的分子與細胞反應，其與整體系統(tǒng)有差異，如何將產生體外毒性的體外濃度與相應體內劑量聯(lián)系的問題是最終未解決的難題。在毒理學整體試驗中禁止直接進行人體試驗。 (三) 體外試驗的優(yōu)缺點 體外毒性試驗的優(yōu)點可歸納在表12—1。它是在大量實驗的基礎上，使體外毒性試驗能替代整體動物試驗，以提供更多的信息。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進行更權威的試驗，無論是整體還是體外試驗。在有些情況下，是要決定一種化學物在所預期的條件下使用是否安全，如新藥物開發(fā)即需要這一評價。④更重要的是由于生物技術的巨大進步，不僅表現在細胞組織及器官培養(yǎng)領域，而且在生物分子技術方面，也為毒性試驗和研究提供了新的方法和工具。在此種情況下，利用經典的整體動物試驗取得完整的毒理學資料極為困難。體外試驗模型(in vitro test)在上述過程中也起著重要的作用，尤其是機理研究方面。過去利用整體實驗動物模型或稱體內試驗(in vivo test)模型所提供的資料，判斷外源化學物及其制品和混合物等對人類健康是否具有損害作用。而且在現有的化合物中，還有相當數量沒有進行必要的毒理學評價。③動物保護主義運動的興起，要求盡量減少動物的使用，而且應當盡量減少痛苦地處理動物。 一、概述 (一) 分類 毒性試驗的目的是提供一些適當的資料，以便確定有關化學物的毒理學性質。可依據體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類：①篩選試驗。③替代試驗?；谏鲜鲈恚w外試驗模型取材范圍很寬，可取哺乳動物的離體臟器灌流、臟器切片溫育、細胞培養(yǎng)、亞細胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。此外，對鑒定毒理學資料有問題的新化學物，可及時終止開發(fā)，減少由資源到產品的投入。 體外毒性試驗系統(tǒng)的利用在目前尚有不足之處：①體外到體內外推的問題。假如有了更全面的毒理學過程的基礎知識，可設計更符合整體動物模型的體外系統(tǒng)。 二、體外試驗系統(tǒng) (一) 臟器灌流 1. 肝臟灌流 是毒理學中研究外源化合物對肝臟損傷及代謝的常見方法。需指出肝灌流時間不能過久，以4h之內為宜，否則肝細胞的功能與生存不能維持。 3. 膈肌膈神經標本 取完整的大鼠膈肌膈神經置于恒溫灌流液中，在幾小時之內可維持基本正常的神經肌肉傳導。切片厚度一般在250μm。 (三) 原代細胞培養(yǎng) 1. 肝細胞原代培養(yǎng) 肝細胞尚未建成傳代的細胞株系，多用原代培養(yǎng)。 利用原代培養(yǎng)的肝細胞可以進行多種毒理學研究。 2. 巨噬細胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法獲取肺巨噬細胞，小鼠可用腹腔灌洗獲得腹腔巨噬細胞，甚至人也可通過肺灌洗得到。例如研究鎘的免疫毒性，證明鎘可以抑制淋巴細胞轉化和抑制白細胞介素2的產生，且在一定條件下使淋巴細胞內游離鈣濃度增加及鈣調素(CaM)活性降低，此為鎘的免疫毒性機理研究提供了線索。用新生1～2日齡大鼠心室肌分離心肌細胞，原代培養(yǎng)4天后，將微電極(直徑)插入細胞內，研究鎘對心肌的影響。進一步證實鎘對心肌有毒性效應。例如1926年Hull等人選育傳代培養(yǎng)的LLCPK1細胞是來源于Hampshire豬。 2. 胚胎細胞 利用胚胎細胞體外培養(yǎng)，篩檢和研究外源化學物的毒性效應。 此外，人胚主動脈平滑肌細胞也可作為標本傳代培養(yǎng)研究金屬的毒理。最常使用的是腦勻漿、肝勻漿，雖然肺、腎、腸等臟器也可制備勻漿，但是因纖維結締組織或肌細胞不易破碎影響勻漿的質量。 (六) 亞細胞組分 將細胞中各亞細胞組分分離和純化，對于深入研究外源化學物的靶位點、探討化學物毒性效應的機理均十分重要。血影為常用的細胞膜標本。 神經末梢斷裂脫落的突觸體(synaptosome)具有類似完整細胞的功能，除可利用突觸體作為標本外，還可進一步制備突觸體膜(synaptosome membrane)。 2. 微粒體(microsome) 尤其是肝細胞制備的微粒體常作為毒理學研究的標本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細胞內質網，即肝細胞的亞細胞組分分離后的微粒體中。又據報道鎘對大鼠肝細胞線粒體Ca2+ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動性下降。由于酶的提純技術復雜，故而在一般毒理學研究中多用臟器勻漿和亞細胞組分作為酶源。經酶動力學分析，有機磷化合物與AChE底物ACh呈競爭性；即有機磷化合物對AChE為競爭性的不可逆性抑制物。在毒理學中以哺乳動物細胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢的原因有三：一是來自公眾要求減少實驗中使用動物數量的壓力；二是非整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗所需的高額費用；三是人們越來越不滿意實驗動物與人體結果之間相關性的缺乏。 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大表123 毒理學研究中常用細胞各種物種的成纖維細胞淋巴母細胞腹水瘤細胞淋巴細胞角質細胞肝 細 胞肝癌細胞腎臟髓質和皮質細胞肺的各種類型細胞培養(yǎng)的背根膠質細胞培養(yǎng)的睪丸細胞膀胱細胞心臟細胞脊髓微血管細胞脂肪細胞 由于哺乳細胞作為體外實驗系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學中，已有許多不同類型細胞應用于毒理學實驗。其基本要求：①精確地溫度控制調節(jié)，℃，箱內溫度的均衡可依賴風扇；②CO2濃度調節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測箱內CO2濃度；使箱內大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內濕度，可用水盤來維持。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細胞，以便依據細胞生長狀況，進行調整或對污染進行補救或處理。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點，但它尚難絕對除去病毒類微生物，而且灰塵過多對凈化作用不利，故超凈工作臺最好安置在清潔無塵的房間。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。 玻璃器皿在實驗室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml； ③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細胞洗滌。 8. 水純化裝置 細胞培養(yǎng)對水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。外購蒸餾水或去離子，應在本實驗室重蒸后使用。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。 電磁攪拌器，微量加樣器等。應特別注意下列問題：①容器，應仔細認真清洗，必要時須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴格選擇品質優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質要標明名稱、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。 2. 小牛血清 是細胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營養(yǎng)物質，對細胞附著和保護也有明顯的作用。 3. 合成培養(yǎng)基 系依據天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質模擬合成的。有時，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。常用的消化液有胰蛋白溶液(％％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)溶液(％)。使用終濃度為10～15mmol／L。消毒措施應在細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)嚴格執(zhí)行。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。或者更簡單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。過