【正文】 明對(duì)硫磷在5109mol／L水平即可抑制突觸體的攝鈣功能，并引起突觸體膜脂流動(dòng)性下降。 (七) 酶 外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。但是不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷化合物對(duì)AChE的親合力可有很大差別。表123為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞類型，其中有些細(xì)胞可來(lái)源于人體組織。進(jìn)行進(jìn)一步的研究，則需要更高級(jí)的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。對(duì)玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。10. 一般設(shè)備 離心機(jī)，用于對(duì)細(xì)胞懸液離心處理，以達(dá)到細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度等。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。如最簡(jiǎn)單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。 5. 其它 pH調(diào)整液，為了營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長(zhǎng)貯存時(shí)間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時(shí)，均在臨用前加入NaHCO3溶液。細(xì)胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細(xì)菌、真菌及病毒，它們主要來(lái)源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時(shí)間過(guò)久等。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。 (一) 污染鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。％高氯酸處理。 2. 酶漏出的檢測(cè) 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測(cè)也與染料排斥試驗(yàn)有同樣的靈敏度，同時(shí)，可更精確地進(jìn)行定量，但操作時(shí)間較長(zhǎng)。取出上清，放人干凈試管，并保持0℃以下備用，加入等量的溶液至細(xì)胞沉淀，用漩渦混合器混合。 (三) 細(xì)胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細(xì)胞可能發(fā)生某些變化，如細(xì)胞與原始細(xì)胞的差異逐漸加大。雖然不同的細(xì)胞其傳代時(shí)間和更換培養(yǎng)液的時(shí)間不同，但對(duì)于每一細(xì)胞系應(yīng)該較為固定，因?yàn)橹饕Q于細(xì)胞生長(zhǎng)速率。此項(xiàng)指標(biāo)可用于正常細(xì)胞生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)，貯存細(xì)胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一是可選擇來(lái)源于人體的組織細(xì)胞，可減少試驗(yàn)結(jié)果的物種差異。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時(shí)也可采用其它不同的細(xì)胞系，如V7中國(guó)地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照物指采用經(jīng)過(guò)研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。 一、基本技術(shù) (一) 設(shè)備 1. 勻漿器(homogenizer) 常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。d)，大鼠100mg／(kg主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448。 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質(zhì)時(shí)，離心管上層漂浮有脂質(zhì)層，應(yīng)用吸管將其除去，再收集上清液。其方法是在去線粒體的上清液中加入鈣離子，使其終濃度為8mmol／L CaCl2，此時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分產(chǎn)生鈣依賴性聚集，在較低的離心條件，2000~25 000g，20min即可將其沉淀。其解決的辦法有：①小腸上皮細(xì)胞可由打開的小腸內(nèi)面刮取或用機(jī)械振蕩來(lái)與小腸結(jié)締組織分離；②加入胰蛋白酶的抑制劑使蛋白酶活性降低或加入甘油或二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)保護(hù)酶活性；③加肝素防止凝集和蛋白聚集。其最大特點(diǎn)是還原型CytP450與一氧化碳結(jié)合后，在450nm處有最大吸收光譜，因此被稱為CytP450。2. NADHP細(xì)胞色素P450還原酶測(cè)定 NADHP細(xì)胞色素P450還原酶在MFO作用中起提供電子的作用。本法是利用雙光束分光光度計(jì)測(cè)定340nm處光密度的變化量。 2. 氧耗測(cè)定法 采用氧電極法測(cè)定反應(yīng)體系中的氧耗量，通過(guò)化學(xué)計(jì)量法間接了解MFO活力的反應(yīng)體系中，NADPH需要保持恒定的水平，故常用NADPH生成系統(tǒng)，如葡萄糖6磷酸／葡萄糖6磷酸脫氫酶或異檸檬酸／異檸檬酸脫氫酶等來(lái)滿足需要。由于其底物特異性不強(qiáng)，催化反應(yīng)類型較多，目前已建立多種產(chǎn)物的檢測(cè)方法。m11，即肝外組織MFO活力較低，其靈敏度有限。本法比較靈敏，一般高于可見紫外分光光度法2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，可測(cè)出1～30pmol產(chǎn)物生成量／(min芳烴羧化酶活力測(cè)定也是用熒光法，其原理是以苯并(a)芘為底物，與待測(cè)微粒體溫育一定的時(shí)間。 色譜分析法雖然較前述其他方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間和更多的費(fèi)用，但可對(duì)某些外源化學(xué)物經(jīng)MFO催化的整個(gè)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程及其關(guān)鍵產(chǎn)物有全面了解。勻漿速度為1100rpm，用連續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間依次逐漸將杵伸到玻管的底部。它含有全部氧化磷酸化的酶類，對(duì)于觀察呼吸鏈氧化反應(yīng)、ATPase活性及其它部分的反應(yīng)是十分有用的。 用緩沖液重新懸浮沉淀，使終濃度為20mg蛋白／ml，即為亞線粒體制備物。HCl緩沖液。再過(guò)5min，記錄儀不應(yīng)漂移，如還在漂移，說(shuō)明電極有問(wèn)題。封閉電極室后，使線粒體唯一的氧源是呼吸緩沖液中的溶解氣體。當(dāng)ADP消耗完后，呼吸又回到狀態(tài)4。min)。 (二) 線粒體呼吸的抑制作用研究 研究線粒體呼吸的抑制作用，在了解線粒體氧化磷酸化作用中起著重要的作用。 (B) 曲線的上半部分是典型的狀態(tài)3向狀態(tài)4過(guò)渡的軌跡。 由前述可知，用氧電極研究可獲得許多有關(guān)外源化學(xué)物對(duì)線粒體作用的資料。 1. 試劑 (1) ATP合成緩沖液：l0mmol／L Tris一般用恒溫水浴搖床即可滿足要求，其速度為90轉(zhuǎn)／min。min)。在其上依次鋪加45％(W／W)、41％(W／W)和37％(W／W)的蔗糖溶液，形成不連續(xù)的蔗糖密度梯度。此外，還可用放射性核素化學(xué)物、熒光試劑和順磁試劑等對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記，以跟蹤肝細(xì)胞膜在分離時(shí)的去向。此外，低滲制備的紅細(xì)胞膜雖然去除了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)，但膜的封閉性差；有許多泄漏的空穴。 (三) 封閉的紅細(xì)胞膜囊泡 有時(shí)為了深入研。洗滌去除血紅蛋白，即獲紅細(xì)胞膜。但它的不足之處是這些酶在質(zhì)膜上并不總是均勻的，據(jù)之作出判斷有一定的局限性。經(jīng)雙層尼龍布過(guò)濾后，按圖所示操作(04℃下進(jìn)行)。min)。避光，冷藏保存。此外，由于線粒體制備物可保持良好的偶聯(lián)狀態(tài)，一般為2～3h，可進(jìn)行許多測(cè)定，尤其是抑制作用的研究。 (O／E)這兩種曲線，均表現(xiàn)Ca2+可刺激線粒體的呼吸，而鈣組(R．R)可抑制Ca2+刺激的呼吸。再加抗霉素A(Anti—A)可阻斷琥珀酸以后的呼吸鏈。故可計(jì)算出ADP／O比。min)；而丙酮酸加蘋果酸為底物，狀態(tài)3的呼吸速率為5lng atom O／(mg蛋白 (4) RCR的計(jì)算： 記錄內(nèi)源性呼吸2min，即狀態(tài)1。通常，氮?dú)饩€是位于記錄儀調(diào)試時(shí)的記錄零點(diǎn)，此時(shí)電極電壓為零“氮?dú)饩€”與“空氣線”位置之差表示緩沖液的氧濃度。 (4) 穩(wěn)定1~2min后，將記錄儀調(diào)至95％位置。呼吸功能通常是利用氧電極測(cè)定反應(yīng)體系的氧分壓變化來(lái)了解線粒體的呼吸狀況。 ④將上清移至另一離心管內(nèi)，以100000g30min離心，沉降亞線粒體顆粒，其沉淀為紅色，外觀與松香類似。 操作要點(diǎn)是熟練，整個(gè)制備過(guò)程應(yīng)在1h內(nèi)完成。肝臟用濾紙擦干后，稱重。紙層析、薄層層析、氣相色譜及高效液相色譜等層析技術(shù)均可采用，其中以氣相色譜和高效液相色譜應(yīng)用最廣。由于本法靈敏度較高，將出現(xiàn)較高的對(duì)照值，即本底較高。這些方法簡(jiǎn)便易行，適合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，但靈敏度不高，對(duì)于MFO活力較低的肝外組織不宜采用。對(duì)于肝外組織，因甲醛生成速率為2~3nmol可見兩者差異較大，即其底物轉(zhuǎn)變量小于1％，與測(cè)量方法本身的誤差相近，難于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。但在重組酶系中，即由各種純化的MFO組分在體外條件下組成的反應(yīng)體系，例如，由細(xì)胞色素P450的某亞型、NADPH—細(xì)胞色素P450還原酶和磷脂組成的細(xì)胞色素P450重組系統(tǒng)，可避免準(zhǔn)確性和專一性不足的缺點(diǎn)。 (二) 代謝法 代謝法可分為NADPH消耗量測(cè)定、氧耗測(cè)定和MFO催化代謝產(chǎn)物生成量測(cè)定。此法可快速測(cè)定樣品的總細(xì)胞色素P450含量，即各種細(xì)胞色素P450同工酶(或稱亞型)的總和。由于MFO作用的復(fù)雜性以及成分的多樣性，通常認(rèn)為使用單一方法進(jìn)行MFO的評(píng)價(jià)不夠全面和可靠，因此，在毒理學(xué)中是采用多種檢測(cè)分析方法，從不同角度進(jìn)行MFO作用的評(píng)定。對(duì)于結(jié)締組織較多的肺、皮膚等臟器和對(duì)于小腸微粒體的制備較為麻煩。凝膠過(guò)濾法不適于做多個(gè)樣品。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。d)，大鼠80mg／(kg (四) 微粒體酶的誘導(dǎo)方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導(dǎo)劑之一。此緩沖液在4℃條件下，至少貯存12周不變質(zhì)。 2. 離心機(jī) 是亞細(xì)胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，和超速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。對(duì)外源化學(xué)物毒作用機(jī)理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)等，綜合作出評(píng)價(jià)。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗(yàn)和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗(yàn)等指標(biāo)，以判斷受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的大分子合成與降解的有無(wú)作用。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時(shí)將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 解決這個(gè)問(wèn)題有兩個(gè)方法，一是加S9，二是與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。一般性篩選系列化合物的一般毒性時(shí)，應(yīng)選擇生長(zhǎng)迅速且易于處理的細(xì)胞系。接種效率是測(cè)定植入小量細(xì)胞(2~50個(gè)／cm2)后，等生長(zhǎng)至可分辨的小克隆時(shí)，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計(jì)算克隆數(shù)。成纖維樣細(xì)胞系指在單層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的長(zhǎng)度要大于其寬度的兩倍的細(xì)胞，而上皮樣細(xì)胞系指呈多角形的細(xì)胞。用r計(jì)數(shù)器檢測(cè)無(wú)細(xì)胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。 (3) 操作步驟：離心，以適當(dāng)速度使所有細(xì)胞沉淀而不引起細(xì)胞損傷。 ③顯微鏡下，細(xì)胞顯藍(lán)色的為死亡細(xì)胞，尤其是核深染，而未染的細(xì)胞為存活細(xì)胞。最簡(jiǎn)便和最可靠的檢測(cè)支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的一致性，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性有極為重要的影響。一般要求15磅壓力下20min。 (三) 消毒技術(shù) 在細(xì)胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項(xiàng)工作，它直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 4. 消化液 進(jìn)行傳代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為了使細(xì)胞脫離生長(zhǎng)表面和細(xì)胞離散成單個(gè)細(xì)胞，通常使用消化液。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。 培養(yǎng)液在制備過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格操作，避免混入雜質(zhì)。 9. 濾過(guò)消毒裝置 培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒。如有需要可配置貯存器和運(yùn)輸瓶。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—20℃)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。 表122 體外系統(tǒng)——細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 改善效率，減少費(fèi)用 使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細(xì)胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時(shí)間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)取樣 缺點(diǎn) 缺少整個(gè)器官的形態(tài)學(xué)觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 文獻(xiàn)中早已證明有機(jī)磷化合物的主要靶酶是AChE。據(jù)報(bào)道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗(yàn)中，對(duì)線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。 以紅細(xì)胞膜為例，／L鉛作用僅5min，紅細(xì)胞膜遠(yuǎn)紫外色譜就出現(xiàn)改變，表明膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化?，F(xiàn)雖然不少工作已為其它技術(shù)所取代，但是應(yīng)用勻漿作為過(guò)篩與初步研究還是有用的，主要因其制備方法簡(jiǎn)單、制備周期很短，且不需復(fù)雜的設(shè)備。如人胚肺二倍體細(xì)胞在107～108mol／L苯并(a)芘長(zhǎng)達(dá)28～38代傳代培養(yǎng)下，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核外形不規(guī)則、核膜深陷、出現(xiàn)細(xì)橋(tiny bridge)伴分葉核形成、核內(nèi)胞漿包涵體、核仁巨大或多核等細(xì)胞癌變特征。 1. 腎細(xì)胞 由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經(jīng)建立了幾種腎近曲管細(xì)胞株系用于毒理學(xué)研究。 5. 心肌細(xì)胞 心肌細(xì)胞用于毒理學(xué)研究的報(bào)道目前還較少。在體外試驗(yàn)表現(xiàn)毒性較低的化學(xué)物有環(huán)已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和長(zhǎng)春新堿(vincristine)等。不足之處是切片內(nèi)的細(xì)胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達(dá)細(xì)胞內(nèi)。例如有人研究鋅的吸收