生物堆肥現(xiàn)狀及其發(fā)展前景-文庫吧
2025-03-20 23:38 本頁面
【正文】 ria中含有的具有氨氧化樣的16s rRNA和rDNA序列。該研究小組2000年再次證實了PcRDGGE法的有效性和準確性。1．2．2．DNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析為了得到更為精確的分析序列，需要將PcR擴增產(chǎn)物克隆到載體中以構(gòu)建文庫。回收PCR擴增產(chǎn)物，將其克隆到載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑選并驗證插入了目的片斷。經(jīng)驗證后的克隆子利用ARDRA(Amplmed Ribosomal DNA restriction Analysis)方法進行篩選。 從克隆子中獲取質(zhì)粒DNA片斷，可采用全細胞PcR擴增或質(zhì)粒提取方法”1，但后者得到的質(zhì)量較好。將上述得到的質(zhì)粒進行測序，提交GenBank運行BLAsT程序與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行相似性比較。同時，還可利用the Ribosomal DaLabasePmject提供的分析軟件進行同源性分析。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Phylogenetic tree)常用到軟件如MEGA和ARB。這兩種軟件可在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中得到。對食品廢棄物堆肥過程中高溫期的微生物多樣性的研究結(jié)果顯示，通過建立文庫、DNA測序測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，得到的22個16s rDNA序列已在GenBank數(shù)據(jù)庫登陸；通過同源性比較得到的9個高溫菌、9個放線菌屬在堆肥中均未見報道。schloss等跟蹤研究了堆肥起始階段微生物群落。所不同的是，擴增的片斷為16s一23s rRNA基因間隔區(qū)(AmsA)。1．2．3雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種嶄新的分子生物學技術(shù)。它是基于DNA分子堿基互補配對的原理，用特異性的cDNA探針與待測樣品的DNA或RNA形成雜交分子的過程。由于它的高度特異性和靈敏性，近年來被廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的研究中。根據(jù)研究對象的rDNA序列或者相關(guān)數(shù)據(jù)庫中的信息設(shè)計探針，探針的設(shè)計要求專一性較高。該技術(shù)可以在4個層次上對特定的微生物在環(huán)境中的存在、分布和豐度等進行研究。第一層次是直接在環(huán)境樣品上進行原位雜交，通過原位雜交不僅可以測定不可培養(yǎng)微生物的形態(tài)特征及豐度，而且可以在原位分析其空間分布和動態(tài)。第二層次是與富集分離的菌落進行全細胞雜交。最初是以放射性標記的rRNA靶探針用于顯微鏡鑒定單個的微生物細胞。隨著技術(shù)的發(fā)展，熒光標記的rRNA探針與流式細胞計可對混合的微生物種群進行自動分析。第三層次是與環(huán)境樣品中的提取出的DNA和rRNA進行數(shù)量印跡雜交。第四層次是與rDNA的擴增產(chǎn)物或rRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行southem雜交。16s rRNA基因探針研究堆肥過程中細菌群落的動態(tài)變化結(jié)果表明，細菌16s rRNA基因探針開始時僅達到37％的靶目標，但隨后在第84h樣品中達到最大值83％。用假單胞菌屬和低G+c含量的革蘭氏陽性rRNA基因特異性探針得到相應(yīng)的靶結(jié)合率在16％～87％之間。1．3生物標志物方法生物標志物(Biomakers)通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應(yīng)生物量呈正相關(guān)。由于特定結(jié)構(gòu)的標記物標志著特定類型的微生物，因此一些生物標記物的組成模式可作為指紋估價微生物群落結(jié)構(gòu)。測定時，首先使用合適的提取劑提取環(huán)境微生物樣品中的這些化合物并加以純化，然后用合適的溶劑制成合適的樣品用Gc或Lc檢測，最后用統(tǒng)計方法對得到的生物標記物譜圖進行定性定量分析。1．3．1生物醌技術(shù)微生物醌是能量代謝過程的電子傳遞體，不同的微生物含有不同種類和分子結(jié)構(gòu)的醌。因此，環(huán)境樣品中微生物醌的組成，即醌指紋可在一定程度上反映微生物的群體結(jié)構(gòu)。泛醌與甲基萘醌的摩爾比在一定程度上可反映革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之比，呼吸醌與光合型醌的摩爾比則可在一定程度上反映環(huán)境中細菌與藻類的比例。在一定條件下，微生物醌的含量相對穩(wěn)定，故可利用微生物醌測定環(huán)境中的活性微生物的濃度。同時，根據(jù)微生物醌的摩爾組成還可計算出微生物的多樣性和微生物種分布均勻性兩個指標。用微生物醌指紋研究堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果表明，微生物量先升后降，而微生物群落多樣性一直連續(xù)增加。在堆肥起始階段存在真菌和Pmteobateria，在第3—7d Bacilluss spp。是主要的微生物種類，后期出現(xiàn)了多種Adf∞6耐硎n的繁殖，且通過總微生物醌(total qllinine content，TQ)和微生物醌的多樣性(divergence 0f quinmm，DQ)與理化參數(shù)，如c／N比、p
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