《理學(xué)酶工程》ppt課件-文庫吧
2025-02-06 22:20 本頁面
【正文】 ? PEG是一種特別有用的沉淀劑，因為無毒，不可燃性且對大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護作用。 PEG沉淀法能在室溫下進行，得到的沉淀顆粒較大，收集容易。 2022/3/13 19 3)有機溶劑沉淀法 —— 溶解度的差異 ?與水互溶的極性有機溶劑如 甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。 ? 室溫下，這些有機溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。若預(yù)先將有機溶劑冷卻至 0℃以下， 然后在不斷攪拌下將其逐漸加入蛋白質(zhì)溶液中，防止有機溶劑局部濃度過高，則在很大程度上解決變性問題。 ? 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機溶劑分離不同的蛋白質(zhì)。 2022/3/13 20 4）等電點沉淀法 —— 溶解度的差異 ? 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液 pH變化而變化。在溶液 pH值等于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小。 ? 不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點，因此通過調(diào)節(jié)溶液 pH到目的蛋白的等電點，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。 一般用于酶的粗分離。 2022/3/13 21 5）熱變性沉淀法 —— 熱穩(wěn)定性的差異 適用于熱穩(wěn)定性酶。通過控制 T，使大量雜質(zhì)蛋白變性除去。 可用其他輔助因子、底物等方法，使目的酶的熱變性溫度提高。 2022/3/13 22 （ 2）層析分離 是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)）的不同，使各組分的分布程度不同而達到分離。 1）凝膠過濾層析： 分 離酶蛋白時， 分子大小 大于凝膠孔徑的蛋白被凝膠排阻，因而在凝膠顆粒間隙中移動，速度較快；小分子蛋白質(zhì)則可自由出入凝膠顆粒的小孔內(nèi)，路徑加長，移動緩慢。這樣通過一定長度的凝膠層析柱后，大小不同的分子蛋白就被分開了。 2022/3/13 23 Gel 2022/3/13 24 2022/3/13 25 原理 :不同蛋白質(zhì)等電點不同 ,在同一 pH介質(zhì)中電離情況不同，分子所帶電荷不同 ,與離子交換劑的吸附能力不同 . 將離子交換樹脂裝入層析柱。 ? 帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負電荷的蛋白質(zhì)，陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì) . 2） 離子交換層析法 Ion Exchange 2022/3/13 26 2022/3/13 27 離子交換層析的基本原理 ?物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。 2022/3/13 28 原理： 利用生物大分子間 特異的親和能力 來純化生物大分子，如： 抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體； RNA和其互補的 DNA等。 ? 將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，通過洗脫雜質(zhì)即可除去。被結(jié)合的物質(zhì)再用洗脫劑把它從柱上洗脫下來。 3） 親和層析法 2022/3/13 29 利用對配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法 親和色譜顆粒 具有極強的專一性 2022/3/13 31 親和層析的四個要素 Affinity 2022/3/13 32 4） 高效液相色譜層析（ HPLC） ? 特點： ①使用的固相支持劑顆粒很細，表面積很大 ,因而分辨率很高。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 ? 許多類型的柱層析都可用 HPLC來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。 2022/3/13 33 通過高壓泵，連續(xù)的將流動相按一定流速流過柱子，通過進樣器注入樣品混合物。混合物中各組分性質(zhì)不同，因而它們在柱內(nèi)移動速度不同而逐漸分離。 2022/3/13 34 （ 3）酶分離純化的電泳技術(shù) 電泳 — 在外電場作用下，由于蛋白質(zhì)所帶凈電荷的大小和性質(zhì)不同，因而其泳動方向和速率也不同，從而達到分離的目的。 區(qū)帶電泳 —— 樣品溶液在一惰性支持物上進行電泳的過程。電泳后，不同的蛋白質(zhì)組成被分離形成帶狀區(qū)間。區(qū)帶的位置可用專一蛋白質(zhì)染料染色顯示，有些也可利用伴有顏色變化的酶催化反應(yīng)來顯示。 2022/3/13 35 在蛋白質(zhì)組學(xué)中對電泳的分類 ?一維電泳 (one dimensional gel electrophoresis, 1DE)，現(xiàn)在普遍采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE） ?二維電泳 (twodimensional gel electrophoresis, 2DE)，又稱雙向電泳 2022/3/13 36 非變性電泳 (native PAGE)： 遷移率由分子大小、分子形狀、凈電荷多少決定。 SDSPAGE（變性聚丙烯酰胺凝膠電泳） ?在凝膠與緩沖系統(tǒng)中加入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（ SDS），蛋白質(zhì)分子被大量 SDS陰離子包裹，消除了它們間原來攜帶的
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