【正文】 A稱為核酶（ ribozyme），核酶通常具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，如錘頭結(jié)構(gòu)。 九、核酸的一般理化性質(zhì)： 核酸具有酸性；粘度大；能吸收紫外光，最大吸收峰為 260nm。 十、 DNA的變性： 在理化因素作用下， DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈，從而導(dǎo)致 DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，這種現(xiàn)象稱為 DNA的變性。 引起 DNA變性的因素主要有： ① 高溫， ② 強(qiáng)酸強(qiáng)堿， ③ 有機(jī)溶劑等。 DNA變性后的性質(zhì)改變： ①增色效應(yīng)：指 DNA變性后對 260nm紫外光的光吸收度增加的現(xiàn)象； ② 旋光性下降； ③ 粘度降低；④ 生物功能喪失或改變。 加熱 DNA溶液，使其對 260nm紫外光的吸收度突然增加，達(dá)到其最大值一半時(shí)的溫度，就是 DNA的變性溫度（融解溫度， Tm）。 Tm的高低與 DNA分子中 G+C的含量有關(guān)， G+C 的含量越高，則 Tm越高。 十一、 DNA的復(fù)性與分子雜交： 將變性 DNA經(jīng)退火處理，使其重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程，稱為 DNA的復(fù)性。 兩 條來源不同的單鏈核酸（ DNA或 RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，以退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸的分子雜交。核酸雜交可以是 DNADNA，也可以是 DNARNA雜交。不同來源的，具有大致相同互補(bǔ)堿基順序的核酸片段稱為同源順序。 常用的核酸分子雜交技術(shù)有：原位雜交、斑點(diǎn)雜交、 Southern雜交及 Northern 雜交等。 在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進(jìn)行標(biāo)記，這種帶有一定標(biāo)記的已知順序的核酸片段稱為探針。 十二、核酸酶： 凡是能水解核酸的酶都稱為核酸酶。凡能從多核苷酸鏈的末端開始水解核酸的酶稱為核酸外切酶，凡能從多核苷酸鏈中間開始水解核酸的酶稱為核酸內(nèi)切酶。能識別特定的核苷酸順序，并從特定位點(diǎn)水解核酸的內(nèi)切酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）。 —————————— 第四章 酶 一、酶的概念： 酶（ enzyme）是由活細(xì)胞產(chǎn)生的生物催化劑，這種催化劑具有極高的催化效率和高度的底物特異性，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。酶按照其分子結(jié)構(gòu)可分為單體酶、寡聚酶和多酶體系（多酶復(fù)合體和多功能酶）三大類。 二、酶的分子組成： 酶分子可根 據(jù)其化學(xué)組成的不同，可分為單純酶和結(jié)合酶（全酶）兩類。結(jié)合酶則是由酶蛋白和輔助因子兩部分構(gòu)成，酶蛋白部分主要與酶的底物特異性有關(guān)，輔助因子則與酶的催化活性有關(guān)。 與酶蛋白疏松結(jié)合并與酶的催化活性有關(guān)的耐熱低分子有機(jī)化合物稱為輔酶。與酶蛋白牢固結(jié)合并與酶的催化活性有關(guān)的耐熱低分子有機(jī)化合物稱為輔基。 三、輔酶與輔基的來源及其生理功用： 輔酶與輔基的生理功用主要是： ⑴ 運(yùn)載氫原子或電子，參與氧化還原反應(yīng)。 ⑵ 運(yùn)載反應(yīng)基團(tuán)，如?；被?、烷基、羧基及一碳單位等，參與基團(tuán)轉(zhuǎn)移。大部分的輔酶與輔基衍生于維 生素。 維生素（ vitamin)是指一類維持細(xì)胞正常功能所必需的，但在許多生物體內(nèi)不能自身合成而必須由食物供給的小分子有機(jī)化合物。 維生素可按其溶解性的不同分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類。脂溶性維生素有 VitA、VitD、 VitE和 VitK四種；水溶性維生素有 VitB1， VitB2， VitPP， VitB6， VitB12， VitC，泛酸，生物素，葉酸等。 ：即焦磷酸硫胺素，由硫胺素（ Vit B1）焦磷酸化而生成，是脫羧酶的輔酶，在體內(nèi)參與糖代謝過程中 α 酮酸的氧化脫羧反應(yīng)。 FAD：即黃素單核苷酸（ FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（ FAD），是核黃素（ VitB2）的衍生物。 FMN或 FAD通常作為脫氫酶的輔基，在酶促反應(yīng)中作為遞氫體（雙遞氫體）。 +和 NADP+：即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD+，輔酶 Ⅰ ）和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADP+，輔酶 Ⅱ ），是 Vit PP的衍生物。 NAD+和 NADP+主要作為脫氫酶的輔酶，在酶促反應(yīng)中起遞氫體的作用，為單遞氫體。 ：是 Vit B6的衍生物。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可作為氨基轉(zhuǎn)移酶，氨 基酸脫羧酶，半胱氨酸脫硫酶等的輔酶。 ：泛酸（遍多酸）在體內(nèi)參與構(gòu)成輔酶 A（ CoA）。 CoA中的巰基可與羧基以高能硫酯鍵結(jié)合，在糖、脂、蛋白質(zhì)代謝中起傳遞?；淖饔茫酋；傅妮o酶。 ：是羧化酶的輔基，在體內(nèi)參與 CO2的固定和羧化反應(yīng)。 7. FH4：由葉酸衍生而來。四氫葉酸是體內(nèi)一碳單位基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的輔酶。 8. Vit B12衍生物： Vit B12 分子中含金屬元素鈷，故又稱為鈷胺素。 Vit B12 在體內(nèi)有多種活性形式，如 539。脫氧腺苷鈷胺素、甲基鈷胺素等。其中， 539。脫氧腺苷鈷胺素參與構(gòu)成變位酶的輔酶，甲基鈷胺素則是甲基轉(zhuǎn)移酶的輔酶。 四、金屬離子的作用： 1. 穩(wěn)定構(gòu)象：穩(wěn)定酶蛋白催化活性所必需的分子構(gòu)象； 2. 構(gòu)成酶的活性中心：作為酶的活性中心的組成成分，參與構(gòu)成酶的活性中心； 3. 連接作用：作為橋梁，將底物分子與酶蛋白螯合起來。 五、酶的活性中心： 酶分子上具有一定空間構(gòu)象的部位，該部位化學(xué)基團(tuán)集中，直接參與將底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的反應(yīng)過程，這一部位就稱為酶的活性中心。 參與構(gòu)成酶的活性中心的化學(xué)基團(tuán)，有些是與底物相結(jié)合的，稱為結(jié)合基 團(tuán)，有些是催化底物反應(yīng)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的，稱為催化基團(tuán)，這兩類基團(tuán)統(tǒng)稱為活性中心內(nèi)必需基團(tuán)。在酶的活性中心以外，也存在一些化學(xué)基團(tuán)，主要與維系酶的空間構(gòu)象有關(guān)，稱為酶活性中心外必需基團(tuán)。 六、酶促反應(yīng)的特點(diǎn)： 1．具有極高的催化效率：酶的催化效率可比一般催化劑高 106～ 1020倍。酶能與底物形成 ES 中間復(fù)合物，從而改變化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程，使反應(yīng)所需活化能閾大大降低，活化分子的數(shù)目大大增加，從而加速反應(yīng)進(jìn)行。 2．具有高度的底物特異性：一種酶只作用于一種或一類化合物，以促進(jìn)一定的化學(xué)變化，生成一定的產(chǎn)物，這 種現(xiàn)象稱為酶作用的特異性。 ⑴ 絕對特異性：一種酶只能作用于一種化合物，以催化一種化學(xué)反應(yīng)，稱為絕對特異性，如琥珀酸脫氫酶。 ⑵ 相對特異性：一種酶只能作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵，催化一類化學(xué)反應(yīng)，稱為相對特異性，如脂肪酶。 ⑶ 立體異構(gòu)特異性：一種酶只能作用于一種立體異構(gòu)體，或只能生成一種立體異構(gòu)體，稱為立體異構(gòu)特異性，如 L精氨酸酶。 3．酶的催化活性是可以調(diào)節(jié)的：如代謝物可調(diào)節(jié)酶的催化活性，對酶分子的共價(jià)修飾可改變酶的催化活性，也可通過改變酶蛋白的合成來改變其催化活性。 七、酶促反應(yīng)的 機(jī)制： 1．中間復(fù)合物學(xué)說與誘導(dǎo)契合學(xué)說：酶催化時(shí)，酶活性中心首先與底物結(jié)合生成一種酶 底物復(fù)合物（ ES），此復(fù)合物再分解釋放出酶，并生成產(chǎn)物，即為中間復(fù)合物學(xué)說。當(dāng)?shù)孜锱c酶接近時(shí)，底物分子可以誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象以生改變，使之成為能與底物分子密切結(jié)合的構(gòu)象，這就是誘導(dǎo)契合學(xué)說。 2．與酶的高效率催化有關(guān)的因素： ① 趨近效應(yīng)與定向作用； ② 張力作用； ③ 酸堿催化作用； ④ 共價(jià)催化作用； ⑤ 酶活性中心的低介電區(qū)（表面效應(yīng)）。 八、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)： 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要研究酶催化的反應(yīng)速度以及影響反應(yīng)速度的各 種因素。在探討各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，通常測定其初始速度來代表酶促反應(yīng)速度，即底物轉(zhuǎn)化量 5%時(shí)的反應(yīng)速度。 1．底物濃度對反應(yīng)速度的影響： ⑴ 底物對酶促反應(yīng)的飽和現(xiàn)象：由實(shí)驗(yàn)觀察到，在酶濃度不變時(shí)，不同的底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系為一矩形雙曲線，即當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度的增加與底物濃度的增加成正比（一級反應(yīng)）；此后，隨底物濃度的增加，反應(yīng)速度的增加量逐漸減少（混合級反應(yīng)）；最后，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢繒r(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一最大值，不再隨底物濃度的增加而增加（零級反應(yīng)）。 ⑵ 米氏方程及米氏 常數(shù)：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果， Michaelis amp。 Menten 于 1913年推導(dǎo)出了上述矩形雙曲線的數(shù)學(xué)表達(dá)式，即米氏方程： ν= Vmax[S]/(Km+[S]) 。其中， Vmax為最大反應(yīng)速度， Km為米氏常數(shù)。 ⑶Km 和 Vmax的意義： ① 當(dāng) ν=Vmax/2 時(shí)， Km=[S]。因此， Km 等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度。 ② 當(dāng) k1k+2時(shí)， Km=k1/k+1=Ks。因此， Km可以反映酶與底物親和力的大小，即 Km值越小，則酶與底物的親和力越大；反之，則越小。 ③Km 可用于判斷反應(yīng) 級數(shù)：當(dāng) [S]， ν= （ Vmax/Km） [S]，反應(yīng)為一級反應(yīng)，即反應(yīng)速度與底物濃度成正比；當(dāng) [S]100Km時(shí)， ν=Vmax ，反應(yīng)為零級反應(yīng)，即反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān)；當(dāng) [S]100Km 時(shí)，反應(yīng)處于零級反應(yīng)和一級反應(yīng)之間，為混合級反應(yīng)。 ④Km 是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的 Km 值是恒定的，因而可以通過測定不同酶（特別是一組同工酶）的 Km值，來判斷是否為不同的酶。 ⑤Km 可用來判斷酶的最適底物：當(dāng)酶有幾種不同的底物存在時(shí)， Km 值最小者，為該酶的最適底物。 ⑥Km 可用來確定酶活性測定時(shí)所需的底物濃度：當(dāng) [S]=10Km時(shí)， ν=91%Vmax ，為最合適的測定酶活性所需的底物濃度。 ⑦Vmax 可用于酶的轉(zhuǎn)換數(shù)的計(jì)算：當(dāng)酶的總濃度和最大速度已知時(shí)，可計(jì)算出酶的轉(zhuǎn)換數(shù)，即單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。 ⑷Km 和 Vmax的測定：主要采用 LineweaverBurk雙倒數(shù)作圖法和 Hanes作圖法。 2．酶濃度對反應(yīng)速度的影響：當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時(shí)，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，即 ν=k[E] 。 3．溫度對反應(yīng)速度的影響：一般來 說，酶促反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但當(dāng)溫度增加達(dá)到某一點(diǎn)后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應(yīng)速度迅速下降。酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而達(dá)到一最大值時(shí)的溫度就稱為酶的最適溫度。酶的最適溫度與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，因而它不是酶的特征性常數(shù)。低溫時(shí)由于活化分子數(shù)目減少，反應(yīng)速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復(fù)。 4． pH對反應(yīng)速度的影響：觀察 pH對酶促反應(yīng)速度的影響，通常為一鐘形曲線，即 pH過高或過低均可導(dǎo)致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時(shí)溶液的 pH值就稱為酶的最適 pH。人體內(nèi)大多數(shù)酶的最適 pH在 ～ 之間。酶 的最適 pH 不是酶的特征性常數(shù)。 5．抑制劑對反應(yīng)速度的影響： 凡是能降低酶促反應(yīng)速度，但不引起酶分子變性失活的物質(zhì)統(tǒng)稱為酶的抑制劑。按照抑制劑的抑制作用，可將其分為不可逆抑制作用和可逆抑制作用兩大類。 ⑴ 不可逆抑制作用： 抑制劑與酶分子的必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡單方法使酶活性恢復(fù)的抑制作用就是不可逆抑制作用。如果以 ν ～ [E]作圖，就可得到一組斜率相同的平行線，隨抑制劑濃度的增加而平行向右移動(dòng)。酶的不可逆抑制作用包括專一性抑制（如有機(jī)磷農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制）和非專一 性抑制（如路易斯氣對巰基酶的抑制）兩種。 ⑵ 可逆抑制作用： 抑制劑以非共價(jià)鍵與酶分子可逆性結(jié)合造成酶活性的抑制，且可采用透析等簡單方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復(fù)的抑制作用就是可逆抑制作用。如果以 ν ～ [E]作圖，可得到一組隨抑制劑濃度增加而斜率降低的直線。可逆抑制作用包括競爭性、反競爭性和非競爭性抑制幾種類型。 ① 競爭性抑制：抑制劑與底物競爭與酶的同一活性中心結(jié)合，從而干擾了酶與底物的結(jié)合，使酶的催化活性降低，這種作用就稱為競爭性抑制作用。其特點(diǎn)為： 類似物或反應(yīng)產(chǎn) 物； ； ，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減?。?： Km 值增大， Vm值不變。典型的例子是丙二酸對琥珀酸脫氫酶（底物為琥珀酸）的競爭性抑制和磺胺類藥物（對氨基苯磺酰胺）對二氫葉酸合成酶（底物為對氨基苯甲酸）的競爭性抑制。 ② 反競爭性抑制：抑制劑不能與游離酶結(jié)合，但可與 ES復(fù)合物結(jié)合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競爭性抑制。其特點(diǎn)為： ； b.必須有底物存在，抑制劑才能對 酶產(chǎn)生抑制作用； ： Km 減小， Vm 降低。 ③ 非競爭性抑制：抑制劑既可以與游離酶結(jié)合，也可以與 ES復(fù)合物結(jié)合，使酶的催化活性降低，稱為非競爭性抑制。其特點(diǎn)為： ； 酶與底物的結(jié)合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響； ： Km值不變， Vm 值降低。 6．激活劑對反應(yīng)速度的影響：能夠促使酶促反應(yīng)速度加快的物質(zhì)稱為酶的激活劑。酶的激活劑大多數(shù)是金屬離子，如 K+、 Mg2+、 Mn2+等，唾液淀粉酶的激活劑為 Cl。 九、酶的調(diào) 節(jié)： 可以通過改變其催化活性而使整個(gè)代謝反應(yīng)的速度或方向發(fā)生改變的酶就稱為限速酶或關(guān)鍵酶。 酶活性的調(diào)節(jié)可以通過改變其結(jié)構(gòu)而使其催化活性以生改變，也可以通過改變其含量來改變其催化活性，還可以通過以不同形式的酶在不同組織中的分布差異來調(diào)節(jié)