《昆蟲桿狀病毒載體》ppt課件-文庫吧
2024-12-24 04:46 本頁面
【正文】 : 立即早期基因表達(dá) 、 早期基因表達(dá) 、 晚期基因表達(dá) 和 極晚期基因表達(dá) 。 早于 DNA 復(fù)制 病毒 DNA 合成 ? 多角體蛋白 是形成包含體的主要成分，感染后期在細(xì)胞中的積累可高達(dá)30% ~ 50%，是病毒復(fù)制 非必需成分 ，但對病毒粒子卻有 保護(hù)作用 ，可使之保持穩(wěn)定和感染能力。 ? P10 蛋白 為另一類高效表達(dá)的極晚期蛋白，也是一類病毒復(fù)制 非必需成分 ，可在細(xì)胞中形成纖維狀物質(zhì)，可能與 細(xì)胞溶解 有關(guān)。 理想的外源基因插入位點(diǎn) 桿狀病毒載體 ?載體重組原理：原理是人為將桿狀病毒多角體蛋白兩翼序列的同源序列引入含外源基因的質(zhì)粒載體中，通過同源重組方式來實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)Σ《径嘟求w蛋白基因的替換。 ?由于桿狀病毒分子質(zhì)量約為 134kb，不能利用 多克隆位點(diǎn)（酶切連接）進(jìn)行基因重組，只能利用桿狀病毒和帶有外源基因的 質(zhì)粒載體 進(jìn)行 共轉(zhuǎn)染 （轉(zhuǎn)移載體的介導(dǎo)）。 ?多克隆位點(diǎn)： DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。能為外源 DNA提供多種可插入的位置或插入方案。 ?共轉(zhuǎn)染： 物理上不相連的基因被整合到同一整合序列并在同一轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的現(xiàn)象。 桿狀病毒載體 ① 將極晚期基因 ( 如多角體基因及其邊界區(qū) ) 克隆 入細(xì)菌的質(zhì)粒中 ② 消除 其編碼區(qū)和不合適的酶切位點(diǎn) ③ 保留 其 5c端對高效表達(dá)必需的調(diào)控區(qū) ④ 在下游 引入 合適的酶切位點(diǎn)供外源基因的插入，即得到 轉(zhuǎn)移載體 。 ⑤ 將要表達(dá)的外源基因 插入 其啟動子下游 ⑥ 與野生型 AcNPV DNA 共轉(zhuǎn)染 昆蟲細(xì)胞 ⑦ 通過兩側(cè)同源邊界區(qū)在體內(nèi)發(fā)生 同源重組 ，使多角體蛋白基因被外源基因取代。 桿狀病毒載體 ?由于 多角體基因 被破壞，則不能形成多角體。這種表型在進(jìn)行常規(guī) 空斑測定 時，可同野生型具有多角體的病毒空斑區(qū)別開來， 這就是最初的篩選重組病毒的方式。 ?由于重組效率較低 ( 0. 1%~ 1%) ，表型差別不顯著，應(yīng)用上有一定的困難。 桿狀病毒載體 ?為此，經(jīng)過不斷探索，在重組桿狀病毒的篩選與鑒定方面取得了很大改進(jìn)。 ?具體方法有以下幾種： 基因 基因 Bacmid ? Luckow 等開發(fā)?？焖佟⒏咝Мa(chǎn)生重組 AcMNPV 病毒。取桿狀病毒 ( baculovirus) 和質(zhì)粒 ( plasmid) 的英文字頭字尾命名為 Bacmid，即桿狀病毒質(zhì)粒之意。 ?根據(jù) F因子載體原理，用類似于酵母體內(nèi)重組的方法， 構(gòu)建 了一種新桿狀病毒穿梭載體 Bacmid。該載體可像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中生長，又對鱗翅目昆蟲細(xì)胞具有感染性。 ? Bacmid 含有 F因子復(fù)制子 ( 可在大腸桿菌中復(fù)制 ) 、卡那霉素抗性基因及 Tn7 轉(zhuǎn)座位點(diǎn) attTn7。 ?轉(zhuǎn)移載體中，外源基因
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