初級分離,沉淀分離-文庫吧
2024-10-04 12:02 本頁面
【正文】 ?電位 Nernst電位 ionic strength 3)、 |pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value? zeta電勢 ? 水化層 ? 靜電排斥 ? Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell 蛋白質(zhì)沉淀方法分類 1） 、 鹽析法 2） 、 有機(jī)溶劑沉淀法 3） 、 |pH水 – pI| Value 調(diào)節(jié)法 4） 、 親水聚合物沉淀法 5） 、 聚電解質(zhì)絮凝法 6） 、 高價金屬離子沉淀法 7） 、 親和沉淀法 鹽析沉淀 機(jī)理： A、 ?zeta potential； B、 ?hydration shell 鹽溶 ―鹽溶 ” 現(xiàn)象 —低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大 鹽析 ―鹽析 ” 現(xiàn)象 —高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降 鹽析沉淀 計算 : Cohn經(jīng)驗公式 式中 , S為蛋白質(zhì)的溶解度 (g/L)； I 為離子強(qiáng)度； β 值為蛋白質(zhì)在純水中 (I=0時 )的假想溶解度對數(shù)值 ， 是 pH值和溫度的函數(shù) ， 在蛋白質(zhì) pI時最??； Ks為鹽析常數(shù) ， 與溫度和 pH值無關(guān) 。 ci為離子 i的摩爾濃度； Zi為所帶電荷數(shù)； 221ii ZcI ?? 鹽析沉淀 計算 : Cohn經(jīng)驗公式 有時為簡單計，也可以用濃度代替離子強(qiáng)度，則上式成為 m為鹽的摩爾濃度 鹽析沉淀 方法 : A、 “ Ks”分級鹽析法：在一定 pH值及溫度下 ，改變 鹽濃度 （ 即 I）達(dá)到沉淀的目的 。 B、 “ β”分級鹽析法：在一定 I下 ， 改變?nèi)芤旱?pH值及溫度 達(dá)到沉淀的目的 。 C、 應(yīng)用：一般的初步分離用第一種方法 ，進(jìn)一步純化時用第二種方法 。 鹽析沉淀 ? Ks鹽析法 :由于蛋白質(zhì)對離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。 ? β鹽析法 :由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。 鹽析沉淀 影響因素 A、 無機(jī)鹽種類 一系列鹽沉淀蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行了測定研究 。 陰離子排序為：檸檬酸根 3 酒石酸根 3 F IO3 H2PO4 SO4 CH3COO Cl ClO3 Br NO3 ClO4 I CNS。 對陽離子排序為： Al3+ H+ Ba2+ Ca2+ Cs+ NH4+ K+ Na+ Li+ 如何設(shè)計實驗 ？ 結(jié)論 ？ 鹽析沉淀 結(jié)論： a 不同種類的鹽主要影響 Ks； b 離子半徑小 ， 帶電多 ， 電荷密度高 ， 鹽析效果好 。 無機(jī)鹽的挑選原則： a 較高的鹽析效能； b 高溶解度 ， 能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液； c 溶解度受溫度的影響??； d 鹽溶液的密度不高 ， 便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離； e 不易引起蛋白質(zhì)的變性； f 價格低廉； 62 26 最常用 (NH4)2SO4 ?優(yōu)點(diǎn)：符合上述要求； ?缺點(diǎn)：水解后溶液 pH降低，在高 pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強(qiáng)，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除盡。 ?次常用 Na2SO4。 缺點(diǎn)：在 400C以下溶解度較低，主要用于熱穩(wěn)定蛋白。 鹽析沉淀 B、 無機(jī)鹽添加方式 鹽析沉淀 C、 溫度 T T影響 Cohn方程中的 ?值 。T ?， ? ?； T ? ， ? ?。 Why? P39 離子強(qiáng)度較高時 ， 升高溫度有利于蛋白質(zhì)失水 溶解度下降 鹽析沉淀 D、 溶液 pH pH影響 Cohn方程中的 ?值 。 見圖 圖有何用 ？ pH=pI時 ， 蛋白質(zhì)溶解度最小 （ ?值最小 ） 鹽析沉淀 鹽析沉淀操作 ， 以硫酸銨為例 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因為高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速度和較長的離心時間。 200C時，硫酸銨的飽和溶解度是 761g/L（ 1L水加 761g硫酸銨），飽和溶液體積為 ，飽和濃度為 (534g/L)，定義為 100%飽和度 鹽析沉淀 20℃ ， 硫酸銨添加量計算 （ M摩爾濃度 ， S飽和度 ） 0℃ ， 硫酸銨添加量計算 25 ℃ 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 具體操作方法 見教材 40頁 ： 等電點(diǎn)沉淀法 isoelectric point precipitation 62 35 等電點(diǎn)沉淀法 在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀的操作稱為等電點(diǎn)沉淀 不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。 生產(chǎn)胰島素時，在粗提液中先調(diào) 蛋白質(zhì)，再調(diào) 酸性蛋白質(zhì)。 pH=pI 等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法中的 pH值作用于β值而隱含在 Cohn公式中 ， pI值通常在 pH4~6范圍內(nèi)變化 ，
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