【正文】 若在反應(yīng)中加入 CoA，可使靈敏度提高 10倍；或由發(fā)光細(xì)菌（ Photobacterium fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與 FMN氧化還原酶聯(lián)用，通過 NAD(P)H的變化測(cè)定酶活 。 8） 發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類 1. 復(fù)制起點(diǎn)的種類 1) 核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn) a. 染色體復(fù)制起點(diǎn) —原核生物 (環(huán)狀 )和真核生物 (線狀 )染色體 b. 染色體外復(fù)制起點(diǎn) i. 質(zhì)粒 —DNA,RNA,線狀 ,環(huán)狀 ,單鏈 ,雙鏈 ii. 病毒 —同上 , 細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi) 2) 核外復(fù)制起點(diǎn) a. 線粒體 —所有真核細(xì)胞 b. 葉綠體 —所有綠色植物細(xì)胞 原核與真核生物 兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 3. 按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體 1) 質(zhì)粒復(fù)制型 —復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)粒或線粒體和葉綠體 2) ARS復(fù)制型 —ARS（ autonomus replicative sequence)，或稱染色體復(fù)制型 3) 病毒復(fù)制型 —復(fù)制起點(diǎn)來自病毒，若為 RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 4) 混合復(fù)制型 a. 同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合 —質(zhì)粒形式存在；質(zhì)?；虿《拘问酱嬖? 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 例：大腸桿菌（ ）的 噬粒 （ phagemid）載體既含有來自質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又含有來自噬菌體（如 M13）的復(fù)制起點(diǎn)。在不同條件下，它可以質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，從而獲得質(zhì)粒 ds DNA或噬菌體 ss –DNA 又如：釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的某些載體既含有質(zhì)粒（ 2μ ）復(fù)制起點(diǎn)，又含有 ARS片段 b. 不同生物復(fù)制起點(diǎn)混合 —穿梭載體 （ shuttle vector） 兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)?；虿《拘问酱嬖? * 穿梭載體范圍 ：細(xì)菌 —細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌 —酵母菌， 細(xì)菌 —真菌，細(xì)菌 —?jiǎng)游? 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)種類、標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系 1. 復(fù)制起點(diǎn)種類與拷貝數(shù)間的關(guān)系 1) 質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)類型：低拷貝（嚴(yán)緊型， 12 copies，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型， 20 copies，受宿主染色體控制較弱） 2) ARS型載體：拷貝數(shù)較高（約 20 copies） 3) 病毒型復(fù)制起點(diǎn)：高拷貝 2. 標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系 若標(biāo)記基因表達(dá)效率高 ， 宿主細(xì)胞可能不大量產(chǎn)生標(biāo)記基因以滿足選擇壓力要求 ， 因而載體拷貝數(shù)會(huì)降低 。 對(duì)于不同標(biāo)記基因 ， 可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù) 。 如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因 ， 可提高藥物濃度 。 對(duì)于營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因 ， 可降低該基因的表達(dá)效率或更換其他低效率的標(biāo)記基因 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性 1. 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素 1) 復(fù)制起點(diǎn)類型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn) 2) 標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因 2. 影響穩(wěn)定性的因素 1) 復(fù)制起點(diǎn)類型 —低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差 2) 選擇壓力 3) 載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài) —自主復(fù)制型和整合型 宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 定義 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈 DNA分子（ Covalently closed Circular DNA, ccc DNA） 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 自主復(fù)制性 ? 質(zhì)粒 DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ ori）以及一個(gè)控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體 DNA而自主復(fù)制 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 不相容性 ? 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（ RNAI RNAII Rop因子）如果被導(dǎo)入同一細(xì)胞中，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中，就會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng) ，幾種質(zhì)粒中只能有一種長(zhǎng)期穩(wěn)定地留在細(xì)胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 可擴(kuò)增性 ? pMB1或 ColEI類質(zhì)粒在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有 pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚 20213000個(gè)拷貝，這叫做 氯霉素?cái)U(kuò)增 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 攜帶遺傳標(biāo)記 ? 在實(shí)驗(yàn)室中將質(zhì)粒通過物理方法導(dǎo)入受體細(xì)胞，但是即使在最佳條件下，受體細(xì)胞中也只有少數(shù)細(xì)胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進(jìn)入了質(zhì)粒的受體細(xì)胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標(biāo)記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標(biāo)記。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 分類 接合型 和非接合型 嚴(yán)緊性和 松弛型 在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié)