【正文】 豐富的可溶性維生素（ B族維生素，其中包括維生素 BB B6）和少量的脂溶性維生素。乳酸還可以與乳中的 Ca、 P 和 Fe 等礦物質(zhì)形成易溶于水的乳酸鹽，大大提高了 Ca、 P 和 Fe 等礦物元素的吸收利用率。酸奶可補(bǔ)充人體缺少的多種維生素和礦物元素。 酸奶的保健功能 作為世界公認(rèn) 的保健食品，酸奶對人體有多方面的保健功能。酸奶的保健功效源于大量乳酸菌和它的代謝產(chǎn)物，以及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)。其營養(yǎng)保健功效主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： (1)緩解“乳糖不耐受癥”。 (2) 調(diào)節(jié)人體腸道中的微生物菌群平衡，抑制腸道有害菌的生長。 (3) 降低膽固醇水平。 (4) 合成某些抗菌素，提高人體的抗病能力。 (5) 預(yù)防白內(nèi)障。研究表明，酸奶可以預(yù)防白內(nèi)障。 (6) 能起到美容、明目、固齒和健發(fā)的作用。 因此可以說酸奶是僅次于母乳的營養(yǎng)食品。 乳源生物活性肽 乳源生物活性肽 是指與乳中某些蛋白質(zhì)肽鏈的某些片段相同或相似，在乳中固有或在乳蛋白降解過程中產(chǎn)生的具有生物活性的肽類。牛乳中含有大量的蛋白質(zhì)，具有豐富全價(jià)的營養(yǎng)成分，被稱為“白色血液”，其中蛋白質(zhì)含量約為 %～%，其中大約 80%為酪蛋白 (26g/L)，其余的 20%為乳清蛋白 (6g/L)，是生物活性肽的重要來源 [3]。 Mellander（ 1947） [4]等人從酪蛋白中首次獲得了酪蛋白磷酸肽， 1979 年， Brantl 等從喂食牛乳酪蛋白的豚鼠回腸中發(fā)現(xiàn)具有阿片樣活性的短肽 β 酪啡肽 7(β casomorphin7)[5]，這些發(fā)現(xiàn)使得外源活性肽的研究備受關(guān)注，并且漸漸成為乳品行業(yè)的關(guān)注熱點(diǎn)。已有越來越多的研究表明乳蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解會(huì)產(chǎn)生多種對人體有生理調(diào)節(jié)功能的活性成分。迄今為止，通過不同蛋白酶水解牛乳蛋白質(zhì)得到的生物活性肽及其生理功能見表 1。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 3 表 1 來自牛乳蛋白質(zhì)的生物活性肽及其生理功能 [6， 7] 生物活性肽 蛋白前體 生理功能 抗微生物肽 乳鐵蛋白、酪蛋白 抗微生物生長 抗血管緊張肽 酪蛋白 具有 ACE抑制活性、防治高血壓 抗血栓形成肽 酪蛋白 抑制血小板聚集 酪蛋白磷酸肽 酪蛋白 促進(jìn)鈣的吸收 和利用 免疫活性肽 酪蛋白 激活免疫系統(tǒng) 鴉片肽 酪蛋白 類嗎啡性質(zhì) 在這其中研究最多的是酪蛋白磷酸肽 (Casein Phosphopeptides)，簡稱CPPs， CPPs 主要通過蛋白酶水解牛乳酪蛋白而得到的， CPPs 的核心部位是 成串的磷酸絲氨酸和谷氨酸簇， 其 基本結(jié)構(gòu)為 ： SerPSerPSerPGluGlu[8]，近年來發(fā)展起微生物發(fā)酵法制備 CPPs，即直接利用微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生的蛋白酶 (復(fù)合 )降解蛋白質(zhì)，可使蛋白質(zhì)的水解度提高，從而相對地降低酶法生產(chǎn)活性肽的成本。國外用微生物蛋白酶對 植物蛋白和動(dòng)物蛋白進(jìn)行試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)微生物蛋白酶大多具有溶解性好、活力高、專一性強(qiáng)，來源充足和使用方便等顯著優(yōu)點(diǎn)，因此利用微生物蛋白酶是該研究領(lǐng)域及今后研發(fā)的主要方向。 酸奶中的 CPPs 近幾年來國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)天然發(fā)酵乳制品中有 CPPs 的存在，主要由發(fā)酵乳制品（發(fā)酵乳和干酪）加工過程中，由于外源發(fā)酵微生物的加入使乳蛋白降解解產(chǎn)生一些生物活性肽，包括 CPPs，這些肽的存在會(huì)促進(jìn)發(fā)酵乳制品的加工和消費(fèi)。國外有報(bào)道發(fā)酵乳品中存在由乳酸菌的發(fā)酵作用而產(chǎn)生的多肽類物質(zhì) [9] Kawahara 等 (2021)對酸奶和純牛奶用胰蛋白酶處理后得出 CPP 的量分別為171mg/g， 146mg/g，可以看出酸奶中 CPP 的量明顯高于純奶中 [10]。 研究意義和主要內(nèi)容 隨著人們生活水平的提高，人們不光關(guān)注酸奶的營養(yǎng)價(jià)值，更加關(guān)注酸奶中的活性成分及其保健功能。為進(jìn)一步明確酸奶和純牛奶對胰蛋白酶的敏感性及在腸道中可能產(chǎn)生的 CPPs 水平，本文主要探討胰蛋白酶對酸奶和純牛奶 CPPs 產(chǎn)量的影響，其次用胰蛋白酶水解酸奶和純牛奶，以水解度為指標(biāo)，比較兩者 CPPs的生成量。 胰蛋白酶對酸奶水解度及酪蛋白磷酸肽產(chǎn)量的影響 4 2 材料與方法 試驗(yàn) 原料 脫脂乳粉：新西蘭進(jìn)口。 市售 CPPs：明治制果 試驗(yàn)菌種 德氏乳桿菌保加利亞亞種（ L18）：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供 嗜熱鏈球菌（ St）：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供 培養(yǎng)基 乳酸菌保存培養(yǎng)基 脫脂乳培養(yǎng)基：將脫脂乳粉按照 12%比例復(fù)原為脫脂乳，再經(jīng)過 115℃， 10min滅菌制得 主要化學(xué)試劑 無水乙醇，氫氧化鈉，鹽酸，三氯乙酸，氯化鈣， 酶制劑：胰蛋白酶（ 1:250）美國 Sigma公司 試驗(yàn)儀器 名稱 型號 產(chǎn)地 冷凍離心機(jī) GL10M 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司 恒溫水浴鍋 JCHHS26 濟(jì)南精誠實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 紫外可見分光光度計(jì) TU1810 北京普析通用儀器有限公司 超凈工作臺 SWCJ2ED 蘇州安泰空氣技術(shù)有限司 顯 微鏡 CX31 日本奧林巴斯 恒溫培養(yǎng)箱 DHP9082 上海一恒科技有限公司 試驗(yàn)方法 菌種活化 將－ 80℃保藏的純菌種解凍后，用接種環(huán)蘸取少許接種到 5mL 脫脂乳培養(yǎng)基中， 43℃培養(yǎng)至凝乳，活化 3～ 4 代。 L18革蘭氏染色鏡檢，陽性，呈單個(gè)體長桿狀。 St 革蘭氏染色鏡檢，陽性，呈鏈球狀。 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 5 發(fā)酵劑的制備 將活化好的菌種分別接種到 100mL 的脫脂乳中，接種量為 3%， 43℃培養(yǎng)至凝乳，取出后置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩? 酸奶的發(fā)酵工藝 12%脫脂乳→巴氏殺菌→降溫接種→保溫發(fā)酵→冷卻成熟→成品檢驗(yàn) 胰蛋白酶水解樣品制備 CPPs[10] 樣品中蛋白質(zhì)的濃度為 3%，加入適量胰蛋白酶（酶 :底物 =:100），用 3N NaOH 調(diào) pH 為 ，在溫度為 37℃進(jìn)行水解，水解的過程要保持 pH 為 ，水解過程持續(xù) 3h，反應(yīng)結(jié)束后用三氯乙酸滅活胰蛋白酶，后用 1N Hcl 調(diào) pH為 ，4000 r/min 離心 30min，取上清液調(diào) pH 到 再 4000 r/min 離心 30min，取上清，邊攪拌邊加入 20 % CaCl2溶液至質(zhì)量濃度為 %（ w/v） ，再加入等體積的無水乙醇，冰浴 30min，后 4000 r/min 離心 30 min，收集沉淀進(jìn)行透析過夜，凍干沉淀即得 CPPs。 磷（ P）含量的測定 [10] 無機(jī)磷含量的測定 將 CPPs 配制成濃度為 %（ w／ v）的溶液，吸取 %的 CPPs 溶液 2mL 放入細(xì)頸瓶中，加入 2mL 濃度為 70%的高氯酸，再 加入 2mL 濃度為 1%的阿米酚和%的鉬酸銨，混勻，將其定容至 25mL，室溫放置 20min， 720nm 處測定吸光度。 總磷含量的測定 將 CPPs 配制成濃度為 %（ w/v）的溶液，吸取 %的 CPP 溶液 2mL 放入細(xì)頸瓶中，加入 濃度為 70%的高氯酸，加熱混合物 20min 至無色，將其冷卻后加入 20μ L濃度 30%的雙氧水，加熱混合物 5min，使雙氧水完全揮發(fā)，再加入 2mL 濃度為 1%的阿米酚和 %的鉬酸銨，混勻，將其定容至 25mL，室溫放置 20min， 720nm 處測定 吸光度。 P 的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將干燥至恒重的 K2HPO4配制成含 P量 10μ g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取 、 、 、 、 于細(xì)頸瓶中，用蒸餾水補(bǔ)加至 2mL，加入 濃度為 70%的高氯酸，加熱混合物 20min 至無色，將其冷卻后加入 20μ L濃度 30%胰蛋白酶對酸奶水解度及酪蛋白磷酸肽產(chǎn)量的影響 6 的雙氧水，加熱混合物 5min，使雙氧水完全揮發(fā)，再加入 2mL 濃度為 1%的阿米酚和 %的鉬酸銨，混勻，將其定容至 25mL，室溫放置 20min， 720nm 處測定吸光度。以含 P 量為橫坐標(biāo)， OD720的值為縱坐標(biāo) ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 有機(jī)磷的計(jì)算 有機(jī)磷量 =總磷含量－無機(jī)磷含量 （ 1） r（ N／ P）的計(jì)算 31( / ) 14r N P ??總 氮 量總 磷 量 （ 2） 3 結(jié)果與分析 時(shí)間對酸奶和純牛奶水解度的影響 試驗(yàn)在蛋白溶液濃度為 ， pH=，酶 :底物 =:100 的條件下，研究時(shí)間對該酶水解度的影響，結(jié)果見表 2 和圖 1。 表 2 不同時(shí)間蛋白溶液的水解度 時(shí)間（ min） 15 30 60 120 180 240 300 360 酸奶 純奶 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 圖 1 時(shí)間對蛋白溶液的水解度影響05101520250 15 30 60 120 180 240 300 360時(shí)間（m i n ）水解度（%）酸奶純奶 由圖 1可知，在 0～ 180min 酸奶的水解度高于純奶，在 180min 酸奶的水解度達(dá)到最大值為 %，此時(shí)純奶的水解度為 %，純奶的水解度在 300min內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 7 能達(dá)到最大值為 %，根據(jù)食物在人體內(nèi)的滯留時(shí)間為 3h 左右，飲用純奶在小腸內(nèi)水解度未達(dá)到最大值時(shí)，未被水解的部分就會(huì)被排出而浪費(fèi)掉，到 3h時(shí)，酸奶能達(dá)到最大水解度，未被水解的蛋白質(zhì)降低，與純奶相比被人體吸收和利用的蛋白質(zhì)增加。本試驗(yàn)要研究酸奶和純奶進(jìn)入小腸后在 胰蛋白酶的作用下對 CPPs的影響，考慮到食物在人體的滯留時(shí)間，所以選擇 3h 作為胰蛋白酶水解酸奶和純奶制備 CPPs 的最佳時(shí)間。 酶 :底物對水解度的影響 酶 :底物對純奶水解度的影響 試驗(yàn)在蛋白溶液濃度為 %，水解溫度為 37℃， pH= 的條件下，研究該酶在酶 :底物 =:100， :100， :100， :100， :100 時(shí)對純奶蛋白溶液水解度的影響，結(jié)果見表 3和圖 2。 表 3 不同酶 :底物條件下純奶的水解度 時(shí)間（ min） 15 30 60 120 180 240 300 酶 :底物 =:100 酶 :底物 =:100 酶 :底物 =:100 酶 :底物 =:100 酶 :底物 =:100 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。